pan-Aves


Zleva doprava: ara hyacintový (Anodorhynchus hyacinthinus), zdroj: flickr.com (JMJ32); Gigantoraptor a Alectrosaurus, autor Luis V. Rey

Nová metoda pro studium ptačích retropozonů potvrzuje sesterský vztah potápek a plameňáků (Mirandornithes)

1. Co jsou retropozony a k čemu jsou dobré

    O retropozonech jsem na blogu už dvakrát psal v souvislosti s fylogenetikou žijících ptáků. Jde o podtřídu elementů známých jako "skákající geny" (formálně transpozibilní elementy) a i přes minuciózní rozlišování mezi retropozony a retrotranspozony, které někteří autoři obhajují, sem lze zahrnout všechny DNA sekvence, které vznikly reverzní transkripcí mRNA (Zhang et al. 2005). Paradoxní je, že retropozony nikam neskáčou: mohou genom pouze zaplavovat svými kopiemi, nemají ale transpozázu, která by jim umožnila vyříznout se z aktuální pozice a vklouznout jinam. Některé z elementů řazených do této kategorie si umí reverzní transkriptázu kódovat samy: sem spadají třeba LINEs, dlouhé vmezeřené elementy, které zahrnují i tzv. podrodinu CR1 (Chicken Repeats 1), jedny z vůbec nejčastějších ptačích retropozonů. Totéž platí i pro pozůstatky endogenních retrovirů, které ztratily svou infekční schopnost: takovými retropozony jsou LTRs, dlouhé koncové repetice (Ray 2007). Některé elementy z této kategorie ovšem neumějí kódovat ani funkční reverzní transkriptázu a při svém šíření se tak musí spoléhat na jiné skákající geny: to je případ SINEs, krátkých vmezeřených elementů, které se ukázaly být užitečným nástrojem při zkoumání fylogenetických vztahů mezi savci, avšak u ptáků se prakticky nevyskytují.
    Jednou z nejzajímavějších věcí na retropozonech je skutečnost, že vložení každého elementu do genomu provází duplikace cílového místa, přičemž takto vzniklé duplikáty integrovaný retropozon z obou stran olemují (tzv. flanking sequences). Jde o sekvence o délce až stovek nukleotidů a právě díky nim (resp. jejich vysoce konzervovaným regionům) můžeme retropozony identifikovat, a to i velmi, velmi dlouho po samotné inzerci. Waddell et al. (2001) odhadují, že uplyne 250 milionů let, než doklady po inzerci savčího SINE zcela smažou náhodné mutace, a i konzervativnější odhady retropozonům dávají hodně přes 100 milionů let. S takovými časovými intervaly lze nejstarší retropozony bez nadsázky označit za molekulární fosilie, které se z genomu odkrývají právě tak, jako kosti z horniny. Inzerce retropozonů však nejsou něčím, co by se dělo jen daleko v minulosti – dochází k nim jistým tempem neustále. Najdeme-li inzerci tak mladou, že alela, která ji nese, se ještě nestačila zafixovat v populaci (jinak řečeno, v genofondu vedle sebe prozatím koexistuje alela s retropozonem a alela bez retropozonu), může nám toho říct mnoho zajímavého o genetického toku, populační substruktuře, genetické diverzitě nebo míře inbreedingu (Ray 2007). Staré inzerce naopak mohou představovat téměř ideální evidenci o příbuzenských vztazích mezi taxony, a můžeme tak očekávat, že retropozony budou hrát význačnou úlohu v tom, co Joe Felsenstein nazývá "Grand Reunion" – syntézu fylogenetiky a populační genetiky.

Retropozony mohou být užitečné nejen při studiu fylogenetických vztahů mezi vzdálenými taxony, ale i ke sledování populačních změn a diferenciace. Obrázek zachycuje čtyři dceřiné populace vzešlé z jediné populace mateřské, z nichž každá vykazuje vlastní jedinečnou frekvencí výskytu retropozonů na dvou lokusech. Populace zcela vlevo navíc získala zcela novou retropozonovou inzerci na třetím lokusu, která je pro ni unikátní. Takové polymorfické lokusy umožňují identifikovat hybridy nebo stanovit míru genetického toku mezi populacemi. (Zdroj: Ray 2007: Figure 3)

2. Retropozony ve fylogenetice

    K fylogenetické analýze retropozonů stačí většinou obyčejná parsimonie. Evoluce retropozonů je totiž oproti evoluci nukleotidů docela nudná, takže nepotřebujeme všechny ty složité modely s gama-distribuovanou variací v tempu evoluce, proporcemi invariantních pozic atd. Přesto se už objevily návrhy, jak ji modelovat a vyrovnat se s některými z jejich zvláštností: retropozony by se např. mohly do některých lokusů integrovat častěji než do jiných (Han et al. 2011), náhodné mutace by je mohly u různých taxonů zahlazovat různými rychlostmi (Waddell et al. 2001), a inzerce pocházející z multiplikace stejného retropozonu nemají nezávislý výskyt (Miyamoto 1999). Přesto parsimonie i přes své četné chyby (viz zde, zde) stačí, neboť retropozony nejsou jen tak obyčejné znaky. Steel & Penny (2000) ukázali, že mohou-li znaky nabývat dostatečně mnoha stavů, bude parsimonie statisticky konzistentní (= s více daty se bude blížit správnému stromu) pro všechny možné kombinace parametrů – vyhne se tedy i nechvalně proslulému přitahování dlouhých větví ve Felsensteinově zóně. Otázkou je, kolik je "dostatečně mnoho": 4 stavy, které používá většina sekvenčních analýz, rozhodně nestačí, jelikož přitahování dlouhých větví v nich pozorujeme docela běžné. Ale při integraci do ptačího genomu mohou retropozony vklouznout do téměř kterékoli z 1,2 miliard možných pozic, z nichž každá představuje samostatný znakový stav (Matzke et al. 2012). Výjimečnosti retropozonů si v tomto ohledu povšimli jak Steel & Penny (2000), tak Sober (2004) – druhá práce dokonce předem varuje, že při diskuzi o kladech a záporech parsimonie a věrohodnosti bude retropozonové inzerce ignorovat, jelikož obvyklé poučky zde ztrácejí význam. Díky tomu je oprávněné říct, že parsimonie nad retropozonovými daty má stejné vlastnosti jako spolehlivější věrohodnost (Suh et al. 2011a; Matzke et al. 2012).

    Rozbory retropozonových inzercí představují alternativní přístup, jak z DNA dostat fylogeneticky cenné informace. Běžné analýzy, které kódují každý jednotlivý nukleotid samostatně, mají mnohé výhody – téměř neomezený počet znaků s jasně definovanými stavy –, ale také mnoho problémů. Fylogenetický signál může zcela smazat saturace (jev, který nastává, pokud nukleotidová pozice prodělala vícero mutací, než dospěla k nyní pozorovanému stavu), zvláště u rychle se vyvíjejících třetích pozic kodonů; homoplazie v kombinaci s odlišnými rychlostmi evoluce vede k přitahování dlouhých větví, které může svést na scestí každou fylogenetickou metodu (byť některé jsou schopny tuto chybu s více daty napravit); a rizikem je i base composition bias, tedy shlukování taxonů s podobným poměrným zastoupením jednotlivých bází v genomu bez ohledu na reálné příbuzenství.
    Ani jedním z těchto problémů retropozony netrpí. Možnost klasické homoplazie je zde totiž velice omezená: znamenala by buď přesné vyříznutí, nebo nezávislou inzerci stejného typu se stejným zkrácením* a stejnou orientací na totéž místo v genomu. Může se to stát? Ano, může: ukázalo se, že genom má k dispozici mechanizmus pro přesné vystřižení (van de Lagemaat et al. 2005) a že i k paralelní inzerci občas dojde (u ptáků se to zřejmě stalo u sluk a datlů – Han et al. 2011), a nakonec snad přece jen existují tzv. "hot spots", místa, kam se retropozony integrují častěji než jinam (Han et al. 2011). Všechny studie, které se těmito problémy zabývaly, ale došly k závěru, že tyto jevy jsou stále velmi vzácné a nedochází k nim dost často na to, aby představovaly závažný problém (van de Lagemaat et al. 2005; Ray et al. 2006; Ray 2007) – dokonce i Han et al. (2011), kteří toho kolem celé otázky nadělali nejvíc, nakonec uznali, že "TE insertions retain a strong phylogenetic signal and [...] exhibit very little homoplasy" (p. 283), a to navíc jejich metody Matzke et al. (2012) označili za zavádějící a vůči retropozonům neférově tvrdé. Problémy typu přitahování dlouhých větví tedy zcela odpadají. Nemáme navíc důvod předpokládat, že nezávislé inzerce nebo přesné delece dvakrát způsobí přesně ten samý nepravdivý vzorec výskytu. Zdálo by se tedy, že cokoli víc než jedna inzerce se rovná železné jistotě. Waddell et al. (2001) problém uchopili jinak, z hlediska striktně statistického, a zformulovali kritérium ještě tvrdší: k zamítnutí nulové hypotézy jsou třeba aspoň 3 inzerce bez jakéhokoli konfliktního signálu.
    Jediným z velkých problémů sekvenčních dat, kterého se nezbavíme ani u retropozonů, je hemiplazie. Ačkoli stejně jako běžná homoplazie vytváří konfliktní vzorce výskytu znaků, její mechanizmus je odlišný. Je důsledkem jevu známého jako nekompletní třídění linií, který nastává, pokud se ancestrální populace začala štěpit ještě předtím, než se v ní ustálil původní polymorfizmus. Evoluční linie vzešlé z tohoto štěpení zdědí všechny alely obsažené v genofondu původní populace, které se poté zafixují zcela náhodně. O nekompletním třídění linií mluvíme tehdy, když strom sestavený z alel na polymorfickém lokusu (gene tree) nesouhlasí s průběhem fylogeneze (species tree). Často se objevuje při velkých evolučních radiacích, k jaké došlo např. u báze placentálních savců. Právě zde se retropozonové stromy sekly, když Nishihara et al. (2006) odhalili silnou podporu pro klad zahrnující letouny, lichokopytníky, šelmy a luskouny, geniálně pojmenovaný jako Pegasoferae**. Ač podpořen 4 inzercemi, největší sekvenční studie jeho existenci zamítají (Zhou et al. 2011; Meredith et al. 2011). Zároveň jde však o pěknou ukázku toho, že pokud se nám pod rukama plete nekompletní třídění linií, většinou to poznáme: není to totiž tak, že by se všechny genové stromy spikly a společně odporovaly "species tree"; odporují i sobě navzájem. Už Nishihara a spol. si všimli jedné inzerce, jejíž výskyt se s Pegasoferae neslučuje, zato však odpovídá výsledkům sekvenčních analýz. Navíc i samotný výskyt hemiplazie může říct leccos zajímavého o evoluční historii skupiny (Matzke et al. 2012).

*Zkrácení (truncation) poukazuje na skutečnost, že většina inzercí zahrnuje pouze část originální RNA šablony. Důvodem je neúplná reverzní transkripce, která často "vynechává" hlavně u 5' konce původní sekvence (Volff et al. 2001; Han et al. 2011).

**Smím-li citovat z komentáře Mike'a Keeseyho na DML:
What do you call a clade that includes bats, horses, and Ferae (i.e., Carnivora plus whatever it's closest to, in this case pangolins)? Combine the bats and horses into winged horses, and then combine again! I think that's pretty clever.

Retropozonová homoplazie u ptáků podle Hana a spol. (2011). Vpravo jsou zobrazeny fylogenetické stromky vytvořené analýzou nejvyšší věrohodnosti (s bootstrapovými podporami nad 50%), vlevo zarovnané sekvence 4. intronu HMGN2 (a) a 2. intronu GH1 (b). V prvním případě byla zřejmě inzerce retropozonu z rodiny CR1 druhotně ztracena u lenivek (Bucco) a leskovců (Galbula), v tom druhém u "roadrunnera" Geococcyx. U kukalek (Coua) pak došlo k deleci velké části příslušného intronu; retropozon tím byl sice ztracen, nejedná se však o přesné vyříznutí, které jako jediné představuje při rekonstrukci fylogeneze problém. Chyba v topologii je prakticky vyloučena; na monofylii šplhavců (a) a kukaček (b) se shodují data z mtDNA, jaderného genomu, morfologie a dokonce i jiných retropozonů. Konfliktní vzorce výskytu je stále možno vysvětlit hemiplazií, ta se však většinou odehrává na krátkých větvích, zatímco větve vedoucí ke šplhavcům i kukačkám jsou docela dlouhé. (Zdroj: Han et al. 2011: Figure 3)

    Vzhledem k těmto vlastnostem jsou retropozony ideálním nástrojem k nezávislému ověření výsledků sekvenčních analýz. Důležité je zde slovo "nezávislému": není třeba se bát, že sekvenční a retropozonové rozbory využívají dvakrát ta samá data. Ačkoli sekvenční analýza např. jaderných intronů na nějaký ten retropozon pravděpodobně narazí, pořád s ním bude zacházet jen jako s posloupností nezávisle se vyvíjejících nukleotidů. To není špatně: jakmile se retropozon jednou začlení do DNA, skutečně prodělává ty samé náhodné mutace jako každá jiná nekódující DNA; samotná inzerce však představuje proces zcela odlišný. Retropozonová analýza se stará právě jen o tento druhý proces: dokud lze rozpoznat, o jaký typ elementu jde, nejsou bodové mutace v jeho sekvenci důležité. Retropozon zde není kódován jako několik stovek znaků o 4 stavech s nejasnou polaritou, ale jako znak jediný, který se navíc polarizuje zcela sám, bez potřeby nějaké outgroup, takže odvozený stav (přítomnost inzerce) lze od primitivního stavu (absence inzerce) odlišit automaticky.
    Vzhledem k tomu, jak problematické jsou vzájemné příbuzenské vztahy žijících ptáků, není divu, že své naděje do retropozonů začínají vkládat i ornitologové (Livezey 2011; Mayr 2011). První analýzy tohoto typu zde však nastoupily až s určitým zpožděním oproti savcům, a přestože průkopnické studie jsou staré už přes pět let (Watanabe et al. 2006; Kriegs et al. 2007), více se v tomto směru začalo podnikat až zcela nedávno (Suh et al. 2011a; Matzke et al. 2012; Liu et al. 2012). Jednoznačně nejvýznamnější ze všech dosud provedených retropozonových analýz ptáků pak loni publikovali Suh et al. (2011b), jejichž strom přinesl podporu pro nečekaně mnoho skupin již dříve vzešlých z analýz velkého množství sekvenčních dat. Šlo např. o klady Psittacopasserae (složený z papoušků a pěvců) a Eufalconimorphae (papoušci, pěvci, sokoli).
    Zároveň šlo však o ukázku problému, který nedávno zmínil John Harshman v komentáři na Tetrapod Zoology. Retropozonové studie musí být zaměřeny na nějakou konkrétní skupinu či aspoň posloupnost uzlů na kladogramu. Chceme-li znát fylogenetickou pozici pěvců, je nutné zkoumat inzerce sdílené s pěvci. A zatímco analýza takových inzercí dokáže určit relativní fylogenetickou vzdálenost různých skupin od pěvců (papoušci k nim mají nejblíž, sokolovití dál, seriemy ještě dál atd.), vzájemné příbuzenské vztahy čehokoli, co leží mimo tuto páteřní linii – třeba ptáků, kteří tvoří společně samostatný klad a pěvcům jsou tedy vzdálení všichni úplně stejně –, ověřit nemůže. Proto ty rozsáhlé polytomie ve výsledném kladogramu, ve kterých se zcela rozpustila i některá dobře známá a nijak kontroverzní seskupení, jako např. Picocoraciae (šplhavci + "srostloprstí") nebo Strisores (svišťouni + "lelkové"). Není divu: k tomu by byla třeba celá nová sada informativních inzercí, a k tomu je dobré mít osekvenovaný kompletní genom. Ten je zatím k dispozici jen pro kuře (Gallus gallus) a zebřičku pestrou (Taeniopygia guttata) – jenže co když chceme znát příbuzenské vztahy nějakých jiných ptáků?

3. Suh et al. 2012

    Právě na tuto otázku se snaží odpovědět nová studie Alexandera Suha a kolektivu, která byla měsíc zpátky přijata pro publikaci v žurnálu Molecular Biology and Evolution. Autoři připomínají, že ačkoli některé studie zkoumaly retropozony i u ptáků, pro něž ještě není kompletní genom k dispozici (např. Watanabe et al. [2006] u tučňáků), vždy se jednalo jen o několik inzercí, které by rozhodně nestačily k provedení tak rozsáhlé studie, jakou publikovali Suh et al. (2011b). K tomu je potřeba buď získat nové úplné genomy, nebo vynalézt metodu, která dovede retropozony z genomu cíleně vytáhnout. Autoři takovou metodu představili a ihned ji také vyzkoušeli k otestování sesterského vztahu potápek a plameňáků, jedné z nejpozoruhodnějších fylogenetických hypotéz, které se v poslední době u ptáků vyskytly.

Potápka malá, hlavní hvězda nové studie. (Zdroj: birdforum.net, kredit: Nigel Pye)

3.1 Extrakce retropozonů a fylogenetická analýza

    Suh et al. (2012) upravili protokol, který Wang & Kirkness (2005) vytvořili pro populačně-genetickou studii psů založenou na krátkých vmezeřených elementech (SINEs). Jaderná DNA se naštěpí pomocí restrikčního enzymu a podrobí se inverzní polymerázové řetězové reakci (PCR), která jako primery – tedy počáteční místa pro syntézu DNA – používá sekvence typické pro retropozony z rodiny CR1. Elementy z této skupiny tvoří velkou část retropozonů přítomných v ptačím genomu: spolu s dlouhými koncovými repeticemi (LTRs) přes 97% (Suh et al. 2011b). Inverzní PCR umožňuje amplifikaci (tj. zmnožení) i takových úseků DNA, jejichž přesnou sekvenci neznáme, za podmínky, že jsou z obou stran ohraničeny známými sekvencemi (které jsou doplňkové k primerům). Naštěpené fragmenty se při ní nejprve pomocí speciálního enzymu převedou do kruhové formy, která v sobě obsahuje jak známou sekvenci, tak i neznámý úsek, o jehož amplifikaci usilujeme. Následně je aplikován další restrikční enzym, který kruhovou molekulu rozstřihne a znovu ji tak převede do lineární podoby – a protože stříhá uvnitř známé sekvence, nová lineární forma bude obsahovat neznámý fragment ohraničený z obou stran známými sekvencemi, tedy přesně to, čeho jsme se snažili dosáhnout. Na tuto novou lineární molekulu už je pak možné aplikovat běžnou polymerázovou řetězovou reakci. Tímto postupem Suh et al. (2012) vytvořili genomovou knihovnu: soubor mnoha klonovatelných fragmentů DNA (v tomto případě obsahujících CR1 retropozony). Po naklonování a osekvenování už nic nic nebrání tomu, aby se nalezené inzerce využily ve fylogenetické analýze.
    Ukázková studie byla provedena na potápce malé (Tachybaptus ruficollis). Z genomové knihovny sestavené podle výše uvedené procedury Suh et al. (2012) náhodně vybrali 180 klonů fragmentů obsahujících CR1 retropozony a pomocí programu pro zarovnávání (alignment) DNA sekvencí hledali shodu v genomech kuřete a zebřičky. Pokud najde dostatečně vysoký stupeň shody, rozšíří se hledání v obou směrech o další 2 kilobáze. Následuje osekvenování a zarovnání. Pak už nic nebrání tomu, aby byla aplikována přísná kritéria pro identifikaci kandidátních lokusů, která do detailu popsali už Suh et al. (2011b): vhodné jsou jen retropozony z vysoce konzervovaných intronů nebo mezigenových oblastí kratších než 1,5 kilobáze. Těmito požadavky prošlo jen 38 lokusů z původních 180, z nichž dva navíc obsahovaly pouze inzerci sdílenou mezi potápkou a zebřičkou. Jelikož linie vedoucí k zebřičce se už detailní analýzy dočkala (Suh et al. 2011b), autoři tyto dva lokusy vyřadili z další analýzy. Zarovnané sekvence potápky, kuřete a zebřičky se prohledají na zakonzervované oblasti, tedy místa, kde všechny tři genomy vykazují stejnou nebo aspoň velmi podobnou sekvenci. K této sekvenci se vytvoří komplementární primer pro polymerázovou řetězovou reakci. Potřeba je však ještě druhý primer, který ale nemůže být vytvořen na základě stejného postupu: klon fragmentu z genomu potápky obsahuje jen jednu z obou "flanking sequences". Druhý primer je tedy vytvořen čistě na základě předpokladu, že co je stejné u kuřete a zebřičky, bude stejné i u potápek. To je předpoklad docela rozumný (potápky patří do Neognathae, což znamená, že jsou potomky posledního společného předka kuřete a zebřičky), ale občas se samozřejmě sekne: v takových případech navrhují Suh a spol. vytvořit několik alternativních primerů, aby se zvýšila šance dosáhnout s PCR úspěšných výsledků. V tomto konkrétním případě se povedlo najít 15 markerů, které bylo možné osekvenovat napříč taxonomickým vzorkem.
    Z nich Suh et al. (2012) sestavili datovou matrici, v níž je přítomnost retropozonu kódována jako "+" a absence jako "–". Jako OTUs byly použity tři taxony potápek a dvě jejich potenciální sesterské zástupci skupiny. Tou první jsou plameňáci, které v sesterské pozici vůči potápkám odhalují téměř všechna známá data krom některých morfologických znaků (viz níže). Ty jako sesterskou skupinu potápek identifikují morfologicky i ekologicky, pravda, daleko podobnější potáplice (Livezey & Zusi 2007). Daleko zajímavějším fylogenetickým problémem je nicméně hledání sesterské skupiny k celému kladu Mirandornithes, jak skupinu sestávající z potápek a plameňáků pojmenoval Sangster (2005). Brown et al. (2008) a Morgan-Richards et al. (2008) na této pozici odkryli dlouhokřídlé. Obě studie byly založeny na datech z mitochondriální DNA a měly podstatné nedostatky: ta první použila velice rozsáhlý taxonomický vzorek (135 taxonů), ale nekompletní mtDNA sekvence; zatímco ta druhá analyzovala kompletní mt-genomy, avšak u daleko menšího počtu taxonů. Pacheco et al. (2011), kteří zkombinovali to nejlepší z obou studií, přinesli spíše rozporuplné výsledky: v první z dílčích analýz byli sesterským taxonem Mirandornithes opět dlouhokřídlí, ovšem v kombinaci s holuby; v té druhé pak skupina složená z "brodivých", "veslonohých", tučňáků, trubkonosých, potáplic a zcela bizarně i potuů (Nyctibiidae). (Mayr [2011] takové uskupení nazval Aequornithes, potuovité ale v souladu s daty z morfologie i jaderné DNA řadil úplně jinam.) S holuby – resp. s kladem sestávajícím z holubů, mesitů, stepokurů a faetonů – dala mirandornity dohromady také dosud největší studie jaderné DNA (Hackett et al. 2008). Aby otestovali co nejvíce z těchto hypotéz, zařadili Suh et al. (2012) do svého rozboru potáplici, racka a holuba. Škoda je snad jen vynechání mesitů, které coby sesterskou skupinu Mirandornithes ve své vynikající revizi ptačí fylogenetiky navrhl Mayr (2011).

Fylogenetický strom, založený na analýze 15 retropozonových inzercí metodou nejvyšší úspornosti. Tmavošedé kuličky symbolizují fylogeneticky informativní markery odkryté pomocí nové metody; světle šedá kulička nad větví B označuje inzerci objevenou v sekvencích z GenBanku a černá kolečka reprezentují inzerce jedinečné pro daný terminální taxon. Způli vyplněné kolečko označuje dimorfickou (bialelickou) inzerci – v populaci potápky malé se vyskytuje jak alela, která ji nese, tak i alela, která ji postrádá. Hvězdička vyznačuje taxony, pro které přinesla podporu předchozí retropozonová studie zaměřená na větev vedoucí k zebřičce pestré (Suh et al. 2011b). Kladogram vyvrací hypotézu o blízkém příbuzenském vztahu potápek a potáplic, založenou především na pánevní morfologii, a podporuje naopak hypotézu Mirandornithes, podle níž mají ze všech žijících ptáků k potápkám nejblíže plameňáci. Zobrazené taxony jsou (odshora dolů): potápka malá, potápka australská, potápky roháč a žlutorohá, plameňáci, potáplice, racci, holubi, zebřička pestrá a kuře. (Zdroj: Suh et al. 2012: Figure 3)

Fylogram zkonstruovaný metodou nejvyšší věrohodnosti, zobrazující příbuzenské vztahy mezi CR1 elementy přítomnými u potápky malé (tučná písmena na šedém pozadí) a podrodinami stejné skupiny retropozonů známými od kuřete (šedě) a zebřičky malé (černě). Fylogeneze je založena na 0,7 kilobázích z 3’ konce příslušných inzercí a zakořeněna byla podle želví podrodiny CR1 (PSLINE). Zobrazeny jsou bootstrapové podpory nad 50%, 100% hodnoty jsou vyznačené hvězdičkou. (Zdroj: Suh et al. 2012: Figure S2)

3.2 Evoluce retropozonů

    Autoři dělí 15 prozkoumaných inzercí do 4 podrodin podle toho, v jakém období byly aktivní, což koresponduje s tím, na jakém uzlu je odkrývá fylogenetická analýza. Dvě z nich se nacházejí u potápek a plameňáků, avšak u žádného jiného ze zkoumaných ptáků – další důkaz toho, že hypotéza o blízkém příbuzenství potápek a potáplic je chybná a založená pouze na konvergentních podobnostech, vyplývajících ze shodného způsobu plavání pomocí zadních končetin. Podpořena je tím naopak existence kladu Mirandornithes a Mayrovo tvrzení, že sesterský vztah mezi plameňáky a potápkami představuje jeden z nejlépe podložených "kladů vyšší úrovně" v rámci moderních ptáků (Mayr 2004). Jak na DML podotkl David Marjanović, zdá se, že jeden z nejlépe podložených kladů může být klidně přehlížen skoro 250 let: systematiky nikdy nenapadl, dokud jej neodkryli van Tuinen et al. (2001) s kombinovanou analýzou jaderné a mitochondriální DNA. Podpora pro toto seskupení začala rychle vzrůstat, a to jak díky molekulám (Brown et al. 2008; Hackett et al. 2008; Morgan-Richards et al. 2008; Pacheco et al. 2011), tak i dlouho nedoceněným morfologickým datům (Mayr 2004; Manegold 2006), paleontologii (Mayr 2007) nebo parazitologii (Johnson et al. 2006). Nyní se přidávají i retropozony.
    Ze zbylých 13 retropozonů se 3 vyskytují u všech zahrnutých potápek, čímž (statisticky významně) podporují monofylii kladu Podicipediformes. 5 dalších inzercí potvrzuje monofylii kladu Tachybaptus, který zahrnuje jak potápku malou, tak i potápku australskou, v souladu s uznávanou taxonomií potápek (Fjeldså 2004). A konečně posledních pět markerů je autapomorfických pro potápku malou či dokonce nějakou její konkrétní populaci. Jedna z inzercí se dokonce zdá být dimorfická: v genofondu potápek malých je zatím přítomna jak alela s retropozonem, tak i alela bez něj. Jde o vůbec první případ, kdy byla v rámci ptáků zaznamenána retropoziční aktivita specifická pro jediný terminální taxon ("druh"), a o důkaz toho, že by CR1 retropozony mohly být užitečné pro budoucí studie z oblasti populační genetiky (viz výše).
    Studie Suha a spol. je cenná také pro vhled, který vnáší do evoluce samostatných retropozonů. Zajímavá je např. skutečnost, že jedna z inzercí přítomných u všech mirandornitů je blízce příbuzná jednomu podtypu rodiny CR1, který byl zdokumentován u pěvčí linie moderních ptáků (viz obrázek výše). Zatímco v pěvčí linii aktivita této konkrétní skupiny retropozonů končí s neoavianní radiací – období velmi rychlého odštěpování vývojových větví, při kterém vznikly všechny moderní ptačí "řády" mimo hrabavých, vrubozobých a paleognátů a ke kterému zřejmě došlo těsně před koncem křídy –, v linii potápek trvala daleko déle a skončila až s oddělením linie potápek od linie plameňáků před téměř 50 miliony let (Brown & van Tuinen 2011). Suh a spol. uznávají, že se jejich studie zabývala jen malým zlomkem všech CR1 retropozonů obsažených v genomu potápky malé; jejím hlavním cílem však bylo ukázat postup, jakým lze extrahovat retropozony z jakéhokoli ptačího genomu bez nutnosti úplného osekvenování. Metoda podle všeho skutečně funguje: ač autoři tato data neukázali, úspěšně ji dokázali aplikovat i na papouška, sokola a pštrosa emu, aniž by se setkali s nějakým závažným problémem. Postup dále dokáže identifikovat nejen dlouho mrtvé inzerce, jako jsou ty, které sjednocují Mirandornithes (aktivní v raném paleogénu) a Eufalconimorphae (ve svrchní křídě), ale i retropozony aktivní stále nebo aspoň velmi nedávno, jak naznačuje nalezení bialelické inzerce u potápky malé. Cílená extrakce retropozonů pomocí CR1 slibuje odkrýt spoustu markerů potenciálně užitečných pro studium fylogeneze, genomové evoluce a populační genetiky u ptáků a do budoucna snad i jiných skupin.

4. Acknowledgments

    Děkuji Alexanderu Suhovi za to, že mě upozornil na svou novou publikaci, a za ochotu, s níž zodpověděl mé otázky ohledně vlivu homoplazie na retropozonové fylogenetické analýzy – některá z jeho vysvětlení jsem využil i v tomto článku.

Zdroje:

Avolatavis tax. nov. a fylogeneze Pan-Psittaciformes: papoušci byli původně dravci a prodělali složitý vývoj chápavé nohy

    Pokud o nějaké nové práci nedokážu napsat do dvou měsíců od jejího vydání, většinou o ní už nenapíšu vůbec. Tentokrát však udělám výjimku: studie Ksepky & Clarke (2012) o vymřelých papoušcích byla sice v Journal of Vertebrate Paleontology publikována už 29. února (hned vedle další Ksepkovy studie o tučňácích), připadá mi ale příliš zajímavá na to, abych ji na blogu zcela opomněl. Přál bych si vídat takto kvalitních prací ještě více.

1. Úvod: proč se zajímat o papoušky

    Důvodů je samozřejmě celá spousta. Krom těch banálních (je to velká skupina ptáků, kteří jsou navíc často hezky barevní) se najde i celá řada dobrých. Papoušci mají zcela unikátní anatomii lebky (Zusi 1993), která je u všech zástupců stejná bez ohledu na obývané prostředí, geografický výskyt či přesné složení potravy. Do extrému je v ní dovedena typická ptačí schopnost lebeční kineze, tj. pohyblivost zobáku oproti zbytku hlavy (Paul 2002); a zahrnuje zváštní čelistní sval, který nikde jinde nenajdeme (Zusi 1993). Papouščí čelisti jsou vůbec zajímavé – aby také ne, když dovedou louskat ořechy, které člověk nerozbije bez kladiva. Tito ptáci také mají překvapivě spletitou vnitřní fylogenezi, kterou sice v posledních letech uspokojivě rozřešily molekulární studie, ovšem do podoby, která absolutně nepřipomíná staré klasifikace. Tento fakt odráží skutečnost, že papoušci mají za sebou překvapivě dlouhou evoluční historií, sahající snad až 80 milionů let zpět (Wright et al. 2008).
    Snad nejzajímavější jsou ale objevy posledních let, které konečně umožnily pevně usadit papoušky v rámci ptačí fylogeneze; něco, co se ornitologům dlouho nedařilo. Výsledky jsou ale šokující. Sesterský vztah s pěvci (Ericson et al. 2006; Hackett et al. 2008; Suh et al. 2011) sice nebyl ani v nejmenším očekáván, stále by ale docela dával smysl – pěvci konec konců s papoušky sdílí schopnost vokálního učení (však jsou po ní i pojmenováni), a tato skutečnost může být zásadní pro další výzkum evoluce obou skupin (Barker 2011). Jenže výsledná skupina zahrnující jak papoušky, tak pěvce, kterou Suh et al. (2011) pojmenovali Psittacopasserae, je v sesterském vztahu ještě bizarnějším. Tytéž fylogenomické analýzy, které odkrývají Psittacopasserae, totiž zároveň ukazují, že nejbližšími žijícími příbuznými tohoto kladu jsou draví sokoli a poštolky, kteří naopak nemají nic společného s orly, supy, jestřáby a krahujci. Pro ty z nás, kteří nemáme problém splést si motáka kropenatého a raroha prériového, je zpráva, že druhý dravec je ve skutečnosti blíže příbuzný pestrobarevným loriům a neškodným andulkám, jemně řečeno překvapivá. Zřejmě to tak ale opravdu je: příbuzenský svazek papoušků, pěvců a sokolovitých (nazývaný Eufalconimorphae) potvrzují jak studie desítek jaderných lokusů (Hackett et al. 2008; Wang et al. 2011), tak i fylogeneticky velmi cenných "skákajících genů" (Suh et al. 2011).
    Šlo by jen o zajímavou kuriozitku, kdyby tento objev neměl rozsáhlé implikace pro papouščí evoluční historii. Draví sokolovití totiž v rámci převážně býložravých či hmyzožravých eufalkonimorfů nejsou žádnou podivnou deviací; naopak právě oni podle všeho nejvěrněji odrážejí podobu společného předka všech tří extrémně odlišných skupin. Sesterskou skupinou eufalkonimorfů jsou totiž zřejmě seriemy, které – ač všežravé – mají nezpochybnitelnou historii vrcholových predátorů: proslulí "hrůzoptáci" forusrakoidi byli ze všech žijících ptáků nejblíže příbuzní právě jim. Půjdeme-li na kladogramu ještě o jeden uzel hlouběji, narazíme na podivné seskupení tvořené šplhavci, "srostloprstými", trogony, kurolem, sovami, jestřábovitými a jejich příbuznými (souhrnně nazývanými Accipitriformes) a kondory. Pro nás je ale důležité to, že na bázi této rozmanité skupiny opět stojí dravci: kondoři, akcipitriformové a sovy. Buď tedy linie jestřábů a sov, linie seriem a linie sokolů přešly na dravý způsob života každá samostatně, nebo jej zdědily od společného předka. Druhá možnost je úspornější; znamená však, že papoušci (a pěvci) se museli na ořechy, hmyz a plody přeorientovat až druhotně. Tuto hypotézu podporuje i fakt, že v kmenové linii papoušků* nalézáme "raptoriální" taxony, nesoucí řadu povrchních podobností s jestřáby či sovami. A zde se konečně dostávají na řadu Ksepka & Clarke (2012).

*Vydáváme-li se mezi fosilie, můžeme pojem "papoušci" aplikovat na dvě odlišné skupiny. Ta první zahrnuje všechny žijících papoušky, jejich posledního společného předka a všechny (i vymřelé) potomky tohoto předka: nazýváme-ji Psittaciformes a skládá se z kakapovitých (Strigopidae), kakaduovitých (Cacatuidae) a papouškovitých (Psittacidae). Patří-li nějaká fosilie do této skupiny, můžeme si být jistí, že co platí pro všechny žijící papoušky, platilo i pro ni. Alternativou je nazývat papoušky všechny ptáky, kteří jsou (nebo byli) blíže příbuzní Psittaciformes než jakémukoli jinému žijícímu taxonu. Taková skupina se nazývá Pan-Psittaciformes a obsahuje všechno, co obsahovala skupina předchozí; krom toho však i něco navíc. A právě tohle "něco navíc" nazýváme papouščí kmenová linie (angl. "stem group" – jejím zástupcům se může říkat třeba "stem-parrots", česky tedy asi "prapapoušci"): to, co platí pro dnešní papoušky, nemusí nutně platit zde.

2. Papouščí fosilní záznam

    Ksepka a Clarke začínají zeširoka: přehledem fosilního záznamu celé skupiny. Krom podivné mandibulární symfýzy neexistují žádné doklady pro výskyt papoušků před K/Pg rozhraním, a i tato sporná fosilie nejspíše patří oviraptorosaurům (viz loňskou diskuzi na DML). Co se kenozoických nálezu týče, ještě Olson (1985) považoval fosilní záznam papoušků za mimořádně slabý dokonce i na poměry moderních ptáků, od té doby se však mnoho věcí změnilo. Popsány byly celé nové skupiny: Quercypsittidae s 2 podtaxony, Halcyornithidae s 6 podtaxony, nepojmenované fosilie z London Clay Formation, zřejmě náležejících k několika odlišným taxonům (Mayr & Daniels 1998; Mayr 2009), a Psittacopes z proslulého německého Messelu. Tito ptáci sdílí s žijícími papoušky různé množství apomorfií: halcyornitidi už např. disponují zygodaktylní nohou (v níž dva prsty směřují dopředu a dva dozadu – pro šplhavé ptáky jde o ideální uspořádání, které se nezávisle objevilo také u myšáků či šplhavců), postrádají však ještě typický specializovaný zobák. To Psittacopes a kersýpsittidi mají k dnešním papouškům blíž, ale stále ještě postrádali některé jejich typické znaky. Zobák už měl sice krátkou a robustní horní část zobáku, která však ještě nebyla tak silně zahnutá dolů, a ani dolní čelist ještě nebyla tak hluboká a krátká. Spolu s primitivními znaky běháku to naznačuje, že Psittacopes se krmil jiným způsobem, než který známe od dnešních papoušků – ti si totiž pomocí nohou podávají potravu do zobáku, a obě části těla tak propojili do jediného funkčního komplexu, který Psittacopes ještě neměl (Mayr 2009). U kersýpsittidů jsou podobné odhady ekologie těžší, neboť je známe jen z postkraniálních koster. Tyto taxony možná ukazují, že paleogénní prapapoušci obývali jiné niky než jejich dnešní příbuzní; rozhodně ale nejde o dravce.
    Ty do papouščí kmenové linie dodalo až přehodnocení některých fosilií, které byly dříve spojovány s jinými skupinami. Snad nejpřekvapivější bylo, když mezi prapapoušky skončil Messelastur. Tento podivný pták z německého eocénu byl nejprve s určitými výhradami přiřazen k jestřábovitým (Peters 1994), aby jej následně Mayr (2005) proměnil v "přechodný článek" mezi denními dravci a sovami. Zatímco příbuznost obou skupin se předpokládala už v 19. století, Mayrova šílená hypotéza kladla sovy dovnitř denních dravců, blíž k jestřábům, než měli mít třeba hadilovové nebo kondoři. Messelastur v tom hrál důležitou úlohu: Mayr (2005) spatřoval v jeho běháku a tibiotarzu soví apomorfie, zatímco lebka připomínající sokoly měla být pleziomorfická. Fylogenetická analýza jeho úsudek podpořila a messelastura (společně s o něco menším taxonem Tynskya – souhrnně jsou oba ptáci nazýváni Messelasturidae) zařadila do kmenové linie sov. O čtyři roky později však Mayr (2009) svůj názor změnil nečekaným směrem: zaznamenal četné podobnosti mezi messelasturidy a halkyornitidy, přičemž papouščí znaky halkyornitidů evidentně přebíjejí soví znaky messelasturidů. Kompletní kostra messelastura tento závěr potvrdila (Mayr 2011); jeho zobák s hákovitou špičkou a pařáty současně nikoho nenechají na pochybách, že tenhle papoušek byl dravcem. Zatím posledním přírůstkem do papouščí kmenové linie je Vastanavis, špatně známá indická skupina s polo-zygodaktylní nohou (Mayr et al. 2010), o jejímž přesunu jsem něco málo napsal i tady na blogu.

Vlevo: lebka fosilního papouška Messelastur gratulator (A) v porovnání s lebkou poštolky obecné Falco tinnunculus (C). Podobnosti je těžké přehlédnout. (no) výběžek pod zadním koncem kosti jařmové, (psu) nadočnicový výběžek. Bílé šipky ukazují na spodní čelist, která se Mayrovi ve srovnání s dravými ptáky zdála neobvykle vysoká – na papouščí poměry ale nejde o nic neobvyklého. Měřítko odpovídá 1 cm. Vpravo: kladogram zobrazující fylogenetické vztahy mezi papoušky (na obrázku zastoupenými nestorem kea), pěvci (zebřička pestrá) a sokolovitými, jak byly zrekonstruovány na základě sdílení retropozonových inzercí (šedé kuličky nad větvemi). (Modifikováno z Mayr 2005: Figure 1 a Suh et al. 2011: Figure 1)

3. Avolatavis tax. nov.

    Ksepka & Clarke (2012) nicméně dva měsíce zpátky přidali k Pan-Psittaciformes ještě jeden taxon. Pochází z raně eocénních vrstev severoamerické Green River Formation, které tehdy vytvářely systém sladkovodních jezer obklopených nížinnými lesy. Takové prostředí je ideální po fosilizaci, takže z Green River známe ekologicky i fylogeneticky velice rozmanitou ptačí faunu (Ksepka & Clarke 2010a), která zahrnovala i několik prapapoušků: messelasturida Tynskya a dva taxony halkyornitida Cyrilavis. Čtvrtý zástupce této skupiny, kterého popisují Ksepka a Clarke, je znám z artikulované kostry zahrnující pánev, ocasní obratle, kompletní levou nohu a přírodní odlitek nohy pravé. Vztyčení nového taxonu podporuje jedinečný odvozený znak v podobě vejčitého hrbolku na bázi kladky (trochlea) druhé nártní kosti. Fosilní papoušek dostal promyšlené jméno Avolatavis tenens: prenomen je odvozen z latinského "avolare" (odletět) a naráží na skutečnost, že tito ptáci ze Severní Ameriky po eocénu zcela vymizeli, zatímco přívlastek je příčestím od slovesa "držet" a odkazuje na zygodaktylní stavbu nohy.
    Zařazení avolatavise k papouškům podporuje několik znaků. Krom typických proporcí prstních článků na noze jde i o zavalitý běhák, který fylogenetická analýza (viz níže) optimizuje coby synapomorfii celého kladu Pan-Psittaciformes. Zygodaktylní noha je méně jistým znakem, neboť (jak je zmíněno výše) papoušci nejsou zdaleka jediní ptáci, kteří takovým uspořádáním prstů disponují. Mimořádně zajímaví je v tomto ohledu např. skupina po tomto rysu dokonce pojmenovaná, Zygodactylidae z evropského oligocénu a miocénu. Jediná dosud provedená fylogenetická analýza ji zařadila do kmenové linie pěvců (Mayr 2008), což otevírá možnost, že by zygodaktylní noha původně necharakterizovala pouze papoušky, ale klad Psittacopasserae jako celek (Mayr 2009). Avolatavis ale k zygodaktylidům nepatří, jak potvrzuje již zmiňovaný podsaditý běhák a zkrácené proximální prstní články. S nejvyšší pravděpodobností nemá nic společného ani s rovněž zygodaktylním eurofluvioviridavisem, což Ksepka a Clarke usuzují opět především na základě krátkých prstních článků.
    Pokud jde o anatomii, Avolatavis disponuje 7 volnými ocasními obratli (volný v tomto smyslu znamená "nezačleněný do pygostylu"), zatímco většina žijících papoušků jich má jen 5. Od svých nynějších příbuzných jej dále odlišuje mohutnost prstů na noze: všechny vypadají v zásadě stejně, kdežto recentní papoušci mají třetí i čtvrtý prst podstatně robustnější než ten druhý. Pánev oproti tomu vykazuje některé rysy typické pro všechny zástupce Pan-Psittaciformes (tedy pro dnešní papoušky i jejich kmenovou linii), jako je např. kyčelní kost nedokonale přirostlá ke srostlým křížovým obratlům. Opakovaně zmiňovaný krátký, zavalitý běhák je u avolatavise ještě poměrně gracilní oproti tomu, co pozorujeme např. u dnešních kakaduů nebo amazoňanů. Je také patrné, že proximální otvůrek pro vyživující cévy na boční straně běháku se nachází daleko proximálněji (tedy blíž holeni) než analogický otvůrek na vnitřní straně běháku. U žijících papoušků, vastanavise a kersýpsitty je tomu stejně, zatímco jiní prapapoušci tento rys nevykazují; zajímavá je ale hlavně skutečnost, že totéž lze pozorovat u sokolů. Možná by tedy mohlo jít o morfologickou synapomorfii Eufalconimorphae. (Ne že bychom o několika takových už nevěděli – v Jollieho pracích o anatomii dravých ptáků [Jollie 1976–7] se jich skrývá hned několik, a Darren Naish jich nedávno pár vyjmenoval na Tetrapod Zoology.)

Pařáty nového fosilního papouška avolatavise. Zkratky: (fl) příruba na bočním konci hypotarzu, (fvd) distální vaskulární foramen, (fvpl) boční proximální vaskulární foramen, (fvpm) proximální vaskulární foramen na vnitřní straně nohy, (gr) žlábek na kladce druhého metatarzálu, (tb) hrbolek u báze druhého metatarzálu, (tr) odlomená báze příruby nebo přídatné kladky (trochlea accessoria) čtvrtého metatarzálu. (Zdroj: Ksepka & Clarke 2012: Figure 3)

4. Fylogeneze

    Stejně jako u tučňáků (Ksepka & Clarke 2010b), i zde Dan Ksepka a Julia Clarke prezentují fylogenetickou analýzu založenou na kombinovaných datech z genů a morfologie. Už minule jsem psal, že mi to připadá jako skvělý nápad. Zrovna v případě ptáků jsou konflikty mezi molekulami a morfologií docela ostré (byť práce Geralda Mayra ukazují, že i zde jde především o konflikty intramolekulární a intramorfologické) a pokud budeme fylogenetický vztah fosilií vůči žijícím taxonům testovat jen pomocí morfologie, dostaneme pravděpodobně mezi žijícími taxony takové vztahy, které molekuly celou svou vahou odmítají – a to by nemělo být ignorováno. Vezměme si třeba výše uvedenou historii messelastura. Je hezké, že ho analýza našla vedle sov; jenže celý klad (sovy + Messelasturidae) se pak na tomtéž stromku ocitl vedle skupiny (jestřábovití + sokolovití). A žádná, absolutně žádná molekulární analýza nikdy nedokázala odkrýt sesterský vztah mezi jestřáby a sokoly, pokud ji k tomu tedy autoři natvrdo nepřinutili. A jak už jsem napsal výše, Jollie považoval podobnosti těchto dvou skupin dravců za konvergentní už v 70. letech čistě na základě morfologie. Pokud tedy strom obsahuje takto nedůvěryhodná seskupení, můžeme věřit tomu, že zrovna pozici fosilií odhadl správně? Zahrnutí molekul umožňuje se těmto pochybnostem vyhnout.
    Ksepka & Clarke (2012) proto k 105 morfologickým znakům přidali ještě sekvence cytochromu b (mitochondrie), RAG 1 (jádro) a spindlinu, genu z ptačích pohlavních chromozomů (v tomto případě z chromozomu Z), který už dříve využili k rozřešení papouščí fylogeneze de Kloet & de Kloet (2005). Taxon sampling dále zahrnuje 8 žijících papoušků, zastupujících všechny hlavní klady (kakapovité, kakaduovité i papouškovité), a 11 fosilních zástupců Pan-Psittaciformes. Dataset není zcela nový: přišli s ním už Ksepka et al. (2011) a nyní byl pouze rozšířen o 3 OTUs (Messelastur, Vastanavis, Avolatavis) a 4 morfologické znaky. Autoři objasňují volbu kódování: messelasturidní Tynskya byla vynechána, jelikož její holotyp (ač téměř kompletní) je tak poškozený, že z ní lze relevantní znaky vytáhnout jen velmi těžko, a Vastanavis byl zastoupen jediným OTU slepeným dohromady ze známých exemplářů V. eocaena a běháků, které Mayr et al. (2010) přiřadili k "V. sp". Autoři však vyzkoušeli i to, jaký efekt bude na analýzu mít, pokud pro vastanavise nakódují pouze ty znaky, které je možné zjistit z materiálu V. eocaena. Konečně jako outgroup byli použiti pěvci, sokolovití a myšáci: první dvě skupiny klade do blízkosti papoušků fylogenomika, tu třetí morfologie zadních končetin, jaderný gen ZENK a kombinovaná analýza mitochondriálních sekvencí a 9. intronu PEPCK (Cracraft et al. 2004). Není bez zajímavosti, že samotný 9. intron PEPCK dá opět dohromady papoušky s pěvci (Sorenson et al. 2003).
    Výsledky se celkem shodují s tím, co loni odhalili s první verzí této matrice Ksepka et al. (2011). Rozbor byl opět proveden neváženou parsimonií a vyprodukoval 3 nejúspornější stromy, které se lišily jedině vnitřní strukturou halkyornitidů. Vztahy mezi žijícími papoušky byly rozřešeny bez polytomií a kupodivu se na nich shodla kombinovaná i čistě morfologická analýza: jediná věc, kterou morfologie nebyla schopna odhalit, je sesterský vztah amazoňanů (Amazona) a papouška patagonského (Cyanoliseus). Zcela se shodují také s tím, co odkryli Wright et al. (2008) a Schweizer et al. (2010) na základě vícero jaderných lokusů. V kmenové linii je novinkou skupina sjednocující halkyornitidy, vastanavise a messelastura, sjednocený dvěma znaky. Ten první z nich může být pleziomorfický (je znám od řady vymřelých moderních ptáků a dokonce i od ichtyornise), navíc je v rámci Pan-Psittaciformes homoplastický. Druhý znak – krátký medianoplantární hřeben na běháku – už se zdá být spolehlivější, přestože jistou míru homoplazie vykazuje taky. V rámci tohoto nového kladu je na nejbazálnější pozici odkryt Vastanavis. Mayr et al. (2010) jeho pozici sice nedokázali rozřešit, navrhli však, že by mohlo jít o nejbazálnějšího zástupce Pan-Psittaciformes vůbec. Ksepka & Clarke (2012) mu dávají za pravdu: přesunout jej na tuto pozici vyžaduje jen 1 krok navíc a Vastanavis se druží k halkyornitidům a messelasturovi jen tehdy, pokud zahrneme kódování z V. sp. K přesnějšímu určení vastanavisovy pozice budou podle autorů potřeba další fosilie.

Striktní konsenzus 3 nejúspornějších stromů vzešlých z kombinované úspornostní analýzy 105 morfologických znaků, 2 jaderných a 1 mitochondriálního genu. Index rozkladu (udávající, kolik kroků navíc je nutné k tomu, aby daná větev ze stromu zmizela) pro celý dataset je zobrazen nad větví, index rozkladu pro morfologickou analýzu pod ní. Klad, který má pod větví číslo 0, byl jako jediný odhalen pouze v kombinované analýze. Žijící papoušci ("Crown clade Psittaciformes) zahrnují odshora dolů nestora kako, kakadu žlutolícího, kakadu černého, amazoňana pomoučeného, papouška patagonského, andulku vlnkovanou, loriho novoguinejského a loriho mnohobarvého. (Zdroj: Ksepka & Clarke 2012: Figure 4)

    V souladu s předchozími studiemi analýza odhalila klad složený z žijících papoušků, taxonů Quercypsitta, Psittacopes a nepojmenované fosilie z London Clay Formation, stejně jako tomu bylo v analýzách Mayra a Danielse (1998) a Mayra a spol. (2010). Ten podporuje celkem 5 odvozených znaků, jejichž přítomnost ale nelze ověřit u všech zahrnutých taxonů: od kersýpsitty známe jen dva a od avolatavise, který sem také spadá, dokonce jen jeden – konec konců, máme z něj jen pánev a nohu. Sesterský vztah avolatavise a kersýpsitty je podpořen jedinou synapomorfií: dobře vyvinutým zářezem na kladce druhého metatarzálu.

5. Diverzita a evoluce papouščí kmenové linie

    Autoři poznamenávají, že s rozeznáním avolatavise se stali papoušci (či lépe řečeno jejich total klad Pan-Psittaciformes) jednou z nejrozmanitějších skupin, jaká je v ptačí fauně souvrství Green River zastoupena. Zároveň však není nejrozšířenější: pouze jediný prapapoušek (Cyrilavis colburnorum) je znám z více než jednoho exempláře, zatímco jiní ptáci z téhož souvrství, jako je třeba zástupce kmenové linie fregatek Limnofregata, jsou zastoupeny i více než 10 jedinci.
    Morfologie nohy naznačuje, že Avolatavis uměl velmi dobře šplhat po stromech: stejně jako u dnešních arboreálních ptáků jsou i na jeho noze nejdelšími prstními články ty předposlední (Hopson 2001). Ksepka a Clarke připomínají, že absence tohoto znaku ale nemusí nutně znamenat, že schopnost pohybovat se ve větvích ptákovi chyběla, neboť dnešní nelétavý kakapo (Strigops) umí lézt po stromech docela dobře, ač tyto proporce prstních článků nevykazuje. Evoluce prstů na nohou však musela být u papoušků docela komplikovaná: už bylo řečeno, že Avolatavis má všechny prsty zhruba stejně robustní (a Psittacopes i messelasturidi jsou na tom stejně), zatímco u žijících papoušků a halkyornitidů jsou prsty III a IV znatelně mohutnější. Autoři navrhují, že k této modifikaci skutečně došlo dvakrát nezávisle na sobě; snad mohla zlepšovat úchop. Stejně komplexní historii mají i první metatarzál nacházející se na vnitřní straně nohy (přítomný u messelasturidů a žijících papoušků, ale nikde jinde) a zkrácení proximálních prstních článků, které opět prokazatelně souvisí s úchopem (Hopson 2001; druhotně ztraceno u psittakopese). Autoři svou práci uzavírají s tím, že evoluce moderních papoušků zahrnovala složitou sérii znakových transformací.

Alternativní hypotézy o příbuzenských vztazích v rámci Pan-Psittaciformes a evoluci jednotlivých znaků souvisejících s papouščí chápavou nohou. (A) výsledky analýzy Ksepky a Clarke, (B) fylogeneze preferovaná Mayrem a spol. (2010), s avolatavisem dosazeným na základě výsledků Ksepky a Clarke. Čísla odkazují na znakové stavy v datové matrici, kterou Ksepka & Clarke (2012) do své studie zařadili, a znamenají: (81:1) první metatarzál přesunutý na vnitřní stranu běháku; (89:2) plně vyvinutá trochlea accessoria na čtvrtém metatarzálu; (92:1) třetí a čtvrtý prst robustní, druhý gracilní; (93:0) proximální prstní články skoro stejně dlouhé jako ty předposlední (druhotná změna z výrazně zkráceného stavu, který je pro Pan-Psittaciformes charakteristický). (Zdroj: Ksepka & Clarke 2012: Figure 5)

Zdroje: