Viz také:

• Proč neexistují "běžci" (Ratitae), díl 2. – neusaditelné tinamy a 40 nových genů
• Proč neexistují "běžci" (Ratitae), díl 3. – protože to říkají retropozony

    Je to skoro trapné, ale už jsem zase jednou blog bez přijatelné výmluvy zanedbával – dvoutýdenní pobyt v Krasiejowě by sice přijatelný byl, ale už jsem přece jen měsíc zpátky. Pauzu tedy zakončuji s článkem o historickém vývoji hypotéz o "běžčí" polyfylii: tyto nepodložené spekulace systematiků nezdravě posledlých konvergentní evolucí byly nedávno částečně – a zcela nečekaně – oživeny pokroky v molekulární fylogenetice. Mělo jít původně o součást připravovaného článku o nové studii, která tento pohled dále potvrzuje, jenže podkapitola "historický úvod" zbytek článku jaksi přerostla, a tak ji předkládám samostatně.

Názvoslovná poznámka: nemá cenu skrývat to až na konec článku, už jsem to stejně vyzradil v nadpisu a pak pro jistotu ještě jednou v prvním odstavci: podle nejlepších současných poznatků jsou "běžci" umělá, reálně neexistující skupina, a tak jsou v textu důsledně uvozovkováni. Výjimkou je spojení "australasijští běžci", které naopak označuje zcela bezproblémovou skupinu přirozenou. V tomto sousloví  dané slovo do uvozovek nedávám, ale to jen proto, že jím neodkazuji k nějaké podmnožině "běžců" jako takových, nýbrž k samostatné skupině, pro níž náhodou žádné lepší jméno nemám.

1. Jak "běžci" fascinují frustrují systematiky

    "Běžci" jsou bezesporu jednou z nejcharizmatičtějších skupin ptáků. Při pohledu na pštrosa či nandu snad ani nepřekvapiví, že až do 80. let minulého století se historií táhla téměř nepřetržitá linie autorů, kteří "běžce" považovali za zakonzervovanou větev dinosaurů, kteří se nikdy nenaučili létat a svůj původ odvozovali z úplně jiné skupiny teropodů než létaví "karináti" (Lowe 1935; Oliver 1945; Holmgren 1955; Glutz von Blotzheim 1958, 1960; Verheyen 1961; Friant 1968; Barsbold 1983). Embryologická pozorování, stejně jako nespočet podobností ve stavbě křídla a přítomnost pygostylu, takovým spekulacím sice učinila přítrž, přesto se ale od "běžců" stále můžeme dozvědět leccos o dinosauří reprodukční biologii (Varricchio et al. 2008) či metabolizmu (Erickson et al. 2009). Stále také platí, že kasuár a jeho téměř dromeosauridí nohy či nandu, který jinak zcela normálními křídelními drápky disponuje na každém ze tří prstů, jsou nejbližší připomínkou neptačích dinosaurů, jakou v dnešním světě dostaneme.

Darren Naish nedávno u příležitosti vydání druhé edice The Complete Dinosaur na DeviantArtu zpřístupnil své skvělé kresby z kapitoly o moderních ptácích, kterou se mu tam povedlo dostat (kéž by takových knih bylo víc!). Zde tedy stylově seskupení žijících a fosilních paleognátů. (A) kasuár přilbový, Casuarius casuarius; (B) kasuár jednolaločný, Casuarius unappendiculatus; (C) hnědý kivi, Apteryx; (D) kivi Owenův, Apteryx owenii; (E) moa Pachyornis elephantopus; (F) moa Euryapteryx geranoides, detail na hlavu; (G) sloní pták Aepyornis maximus. Kredit: Darren Naish; obrázek použit v souladu s licencí Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0.

    Na druhou stranu "běžce" už od jejich rozeznání v 1. polovině 19. století provází stín pochybností. Jde opravdu o přirozenou skupinu? Sdílejí všichni "běžci" jediného společného předka, který současně nebyl předkem žádného dalšího žijícího ptáka? Pokud ano, dokázal tento předek létat, nebo už schopnost letu ztratil, tak jako jeho dnešní potomci? A pokud byl nelétavý, jak lze tuto skutečnost sladit s pozoruhodným faktem, že všichni známí "běžci" – včetně těch subfosilních, jako jsou ptáci moa nebo sloní ptáci z Madagaskaru – se vyskytují výhradně na pevninách jižní polokoule? Samotné vědecké jméno "běžců", "Ratitae", odkazuje na plochou hrudní kost, postrádající kýl pro úpon masivních létacích svalů, tak typických pro všechny ptáky, a připomínající tak svým tvarem vor (ratis). Přestože většině nelétavých ptáků tento kýl zůstal a jeho absence se nezdála být špatným spojujícím znakem, toto pravidlo neplatí absolutně. Dromornitidi, podivná skupina až půltunových australských ptáků; Gastornis, další nelétavý obr snad blízce příbuzný vrubozobým; Patagopteryx, druhohorní pták stojící mimo ptačí korunní klad (Neornithes); a havajské husám podobné kachny moa-nalo – ti všichni kýl na prsní kosti ztratili také (Chiappe 2002), a přestože některé z těchto taxonů s "běžci" skutečně spojovány byly, třeba výše zmíněné kachny lze tímto způsobem odvysvětlit dost těžko. Podobností mezi těmito taxony a "běžci" je víc: zmenšení rozměrů a počtu křídelních kostí, redukce či ztráta kosti vidličné (furkuly), srůst lopatky a krkavčí kosti do skapulokorakoidu, protažení ilioischiadického otvoru (= prostoru mezi srostlou kostí kyčelní a sedací) v pánvi a zesílení kostí zadních končetin (Houde 1988; Chiappe 2002; Harshman et al. 2008). Pokud se všechny tyto znaky vyvinuly několikrát nezávisle na sobě, můžeme si být jisti, že zrovna v rámci "běžců" se tak stalo pouze jednou?
    Jedním z prvních pochybovačů o monofylii "ratitů" byl Owen (1866), známý coby autor jména Dinosauria a (blíž k tématu) průkopník výzkumů ptáků moa. Owen byl paradoxně jedním z posledních, kdo tyto pochybnosti doprovodil nějakou explicitní alternativní hypotézou, tzn. uvedl, komu jsou podle něj jednotliví "běžci" nejblíže příbuzní, když už ne k sobě navzájem. Jak ukázali Sibley & Ahlquist (1972), pštrosy (Struthio) Owen spojil s dropy (Otididae), kivi a moa (Apteryx, Dinornithidae) s tabonovitými (Megapodidae). Huxley (1867) ve své klasifikaci řadil všechny "běžce" do jediné skupiny, kterou navíc postavil na roveň všem ostatním ptákům dohromady, jinak jsou ale jeho názory na afinitu "běžců" spíše nejasné. Považoval je za zbytky kdysi rozsáhlé skupiny, která tvořila mezičlánek mezi dinosaury a létavými ptáky, což příliš nezní jako argument pro jejich monofylii. Tento Huxleyho pohled formalizoval Fürbringer (1888), když na svém fylogenetickém stromě usadil "běžce" na čtyři oddělené větve různě vzdálené od zbytku ptáků. Jedna z těchto větví, Alectorornithes, zahrnovala i létavé tinamy. Přestože Huxley a Fürbringer bývají citováni jako zastánci protikladných názorů na "běžčí" původ (Sibley & Ahlquist 1972), ve skutečnosti si docela dobře odpovídají. Huxley viděl "běžce" jako "basal stock", z níž vzešli všichni létající ptáci, a Fürbringer je tak zakreslil na strom – "běžci" jsou tam parafyletičtí vůči všem létavým ptákům mimo archeopteryga. (Na druhou stranu ale řada druhotných zdrojů uvádí, že podle Fürbringera se "běžčí" charakteristiky vyvinuly několikrát nezávisle na sobě a nebyly zděděné od společného nelétavého předka. To by znamenalo "běžčí" polyfylii, nikoli parafylii, a odporovalo tedy Huxleyho pohledu. Nemění to ale nic na tom, že ani na Huxleyho nelze pohlížet jako na bezvýhradného zastánce "běžčí" monofylie.)
    Spor mezi zastánci "běžčí" monofylie a polyfylie trval dlouho. Monofylii obhajovali Mivart (1877), Gadow (1893), Beddard (1898) nebo Clark (1901); polyfylii Parker (1895), Pycraft (1900), Stresemann (1927–34) nebo Wetmore (1930). Zastánci polyfylie považovali za podporu pro svou hypotézu embryologické studie, které dokumentovaly četné podobnosti mezi "běžci" a "karináty": např. palec na noze, který je u dospělých "běžců" buď ztracen, nebo – u kiviho – orientován anteromediálně, podobně jako u neptačích teropodů; je u "běžčích" embryií je přítomen a obrácen dozadu stejně jako u normálních ptáků. Tvrdou ranou pro "běžčí" monofylii byla studie McDowella (1948), který ukázal, že paleognátní či dromeognátní typ kostěného patra, okouzlující systematiky už od dob Huxleyho, není možné uspokojivě definovat a sestává ve skutečnosti ze čtyř odlišných morfotypů, charakteristických pro 1) pštrosy, 2) tinamy a nanduy, 3) kivie, moa a snad i sloní ptáky a 4) kasuáry a emu. Mayr & Amadon (1951:4) už konstatovali, že: "the present consensus is that the main groups of these birds are of independent origin." Vše dovedl do konce de Beer (1956), který poskytl přijatelný mechanizmus vysvětlující, proč bychom měli u zcela nepříbuzných skupin ptáků pozorovat tak obrovské množství konvergence. Mělo jít o neotenii, tedy uchování znaků typických pro mláďata do dospělosti. Neotenie dokázala vysvětlit prakticky všechny navrhované znaky sjednocující "běžce", od struktury peří po stavbu kostěného patra. Paradoxní je, že ačkoli právě tehdy dosáhla obliba hypotézy "běžčí" polyfylie vrcholu, ornitologové zcela rezignovali na pokusy určit, které skupiny ptáků mají k jednotlivým "běžcům" nejblíže. Jak ukázali Cracraft et al. (2004), Mayrův zájem o speciaci a populační genetiku zabil jakékoli pokusy o velkoškálovou ptačí fylogenetiku. Wetmore'ovy klasifikace, které tomuto období dominují, jsou kompletně odvozeny od autorů z 19. století; přes Gadowa je lze vysledovat až k Fürbringerovi.
    Období beznaděje však netrvalo dlouho. Dostupnost molekulárních dat a vznik numerické fylogenetiky nejenže obnovily zájem o ptačí fylogenezi, ale také vzkřísily "běžčí" monofylii. Sibley (1960) elektroforézou proteinů z vaječných bílků prokázal blízkou příbuznost kasuárů, emu a pštrosů, byť v případě nanduů raději vyčkával na více dat. Bock (1963) přezkoumal McDowellovy závěry a podpořil "běžce" coby přirozenou skupinu na bázi osteologie. Meise (1963) totéž učinil na základě behaviorálních dat; nejenže spojil "běžce" spolu navzájem a s tinamami, ale neshledal jejich rozdíly o nic většími, než jsou ty v rámci hrabavých. Brzy následoval příval nových důkazů pro "běžčí" monofylii ze studií zkoumajících elektroforézu proteinů z vaječných bílků (Miller & Feeney 1964; Osuga & Feeney 1968), ramfotéku (Parkes & Clark 1966), karotické tepny (Baumel & Gerchman 1968), spermie (McFarlane 1971), mikrokomplementární fixace transferinu a sérového albuminu (Ho et al. 1976; Prager et al. 1976; Prager & Wilson 1980), DNA-DNA hybridizaci (Sibley et al. 1981, 1985) a aminokyselinové sekvence bílkovin z oční čočky (Stapel et al. 1984). Cracraft (1974) pro zastánce "běžčí" monofylie přivlastnil dřívější de Beerovy argumenty pro neotenii – pro něj neotenie představovala jen mechanizmus, kterým "běžci" přišli k odvozeným znakům, které podporují jejich monofylii. Zároveň přišel s mimořádně lákavou myšlenkou, podle níž může být geografický výskyt "běžců" vysvětlen skrze rozpad Gondwany (Cracraft 1973), čímž spustil sérii horečnatých pokusů naroubovat každou novou fylogenetickou hypotézu na pořadí, v němž se dnešní pevniny odštěpovaly z bývalého superkontinentu. Tato kratochvíle ornitology nepustila dodnes (Bourdon et al. 2009; Phillips et al. 2010; Johnston 2011) a co hůř, vstoupila do učebnic jako klasický případ vikariantní biogeografie (Gill 2007).
    Je pozoruhodné, jak málo se grandiózní spor o existenci "běžců" dotkl tinam. Tato skupina neotropických, nepříliš dobře létajících ptáků značně připomínajících vnějším vzhledem hrabavé, byla s "běžci" spojována od raného 19. století. Parker (1864) postřehl, že se jejich kostěné patro nápadně podobá tomu "běžčímu". Huxley (1867), který svou klasifikaci na kostěném patře založil, se tento postřeh rozhodl ignorovat a tinamy zařadil spolu se všemi ostatními non-"běžci" do "Carinatae" (na základě přítomnosti kýlu na hrudní kosti, tedy primitivního znaku), alespoň ale podotkl, že jde o "the most struthious of all carinate birds" (Huxley 1867:426). Následující autoři tak konzervativní nebyli a do svých klasifikací často zahrnuli skupinu, která v sobě "běžce" a tinamy kombinovala, přestože jména jí dávali různá (Garrod 1874 – Struthiones; Stejneger 1885 – Dromaeognathae). Tím jménem, které přežilo do dnešní doby, se náhodou stalo Palaeognathae od Pycrafta (1900). Je to trochu paradoxní, neboť Pycraft nebyl na rozdíl od Garroda a Stejnegera přesvědčen, že pojmenovává monofyl. Jak napovídá etymologie jména (palaios – starý; gnathos – čelist), skupinu vědomě vztyčil na základě primitivního znaku (resp. se domníval, že jde o znak primitivní: to, zda je primitivním stavem paleognátní patro, neognátní patro, nebo ani jedno, je dalším z únavných ornitologických sporů), byl však přesvědčen, že dělení založené na stavbě patra je stále lepší, než dělení postavené na sternálním kýlu, který mohl být ztracen několikrát nezávisle na sobě (viz výše).
    Prakticky všichni předpokládali, že mono- či poly- fyletické jsou vždy obě skupiny současně: s nějakou kombinací "běžčí" monofylie a paleognátní polyfylie či monofyletických paleognátů a polyfyletických "běžců" přišlo překvapivě málo autorů. Dokonce i jedna z nejzajímavějších hypotéz, s níž přišel Pycraft (1900) sám, tuto nudnou dichotomii respektovala. Pycraft si své paleognáty představoval coby polyfyl složený ze dvou přirozených podskupin: jedna měla zahrnovat nandu, tinamy, sloní ptáky a moa s kivii, druhá emu, kasuáry a pštrosy. "Běžci" buď byli viděni jako přirozená skupina, jejímž sesterským taxonem jsou tinamy v rámci monofyletických paleognátů (Bock 1963; Parkes & Clark 1966; Osuga & Feeney 1968; Cracraft 1974; Prager et al. 1976; Prager & Wilson 1980; Sibley et al. 1981, 1985), nebo jako polyfyletické uskupení nepříbuzných linií neognátů, které díky neotenii a společnému způsobu života konvergují na stejné morfologii (a konvergují na ní tak dobře, že ani nepoznáme, které že linie neognátů to vlastně jsou*), v kterémžto případě pak tinamy vždy neomylně zamířily do blízkosti hrabavých (Seebohm 1888; Beddard 1910; Verheyen 1960, 1961; Gysels 1970). Až v 60. letech se s oživením monofylie "běžců" na základě molekulárních (či, jak se tehdy říkalo, biochemických) dat začaly objevovat návrhy na oživení staré, před-pycraftovské dichotomie "Ratitae"/Carinatae. Řada studií byla schopna potvrdit monofylii "běžců", už ale ne jejich blízký vztah k tinamám, či přímo naznačovaly příbuznost tinam a hrabavých – to se týká studií vaječných bílků (Sibley & Ahlquist 1972; Sibley & Frelin 1972), osteologických a paleontologických dat, především těch od litornitidů (Houde 1988), délkových rozdílů v ribozomální DNA (Mindell & Honeycutt 1989) a fylogenetické analýzy mitochondriální 12S rRNA (Cooper et al. 1992).

*Jediným, kdo se namáhal aspoň trochu upřesnit, z kterýchže neognátů by měli být jednotliví "běžci" odvozeni, byl Olson (1985). Podle něj jsou žijící pštrosi (Struthio) blízce příbuzní středoasijským taxonům Eogrus a Ergilornis, které s ním sdílejí na ptačí poměry unikátní dvouprsté nohy a Olsonovi se zdály být ve správnou dobu na správném místě. Snad ale není třeba dodávat, že numerická fylogenetika toto příbuzenství nepotvrdila: Clarke et al. (2005) ukázali, že eogruidi mají blízko k jeřábům.

    Hypotézy o non-monofylii paleognátů zhynuly zaslouženou smrtí s tím, jak se systematikové přesunuli od proteinů k sekvenování mitochondriální a jaderné DNA. Ani to se sice neobešlo bez komplikací (hybridizační studie shlukovaly paleognáty s hrabavými a vrubozobými do "Eoaves", sekvenční analýzy mtDNA s malým taxon samplingem odkrývaly pěvce nebo dokonce jen zpěvné jako sesterskou skupinu všech ostatních ptáků a fakticky tak zanořovaly paleognáty do Neognathae). Na přelomu devadesátých a nultých let už však bylo jasné, že paleognáti jsou monofyletičtí a tvoří sesterskou skupinu ke všem ostatním žijícím ptákům (Groth & Barrowclough 1999; García-Moreno & Mindell 2000). Boje se mezitím přesunuly na vzájemné příbuzenské vztahy mezi "běžci": molekulára se nemohla rozhodnout, zda na bázi patří pštrosi, nanduové nebo klad (pštrosi + nanduové), zatímco morfologie tam tvrdošíjně umisťovala kivie, kteří podle molekul tvoří sesterskou skupinu kasuárovitých. Takové spory jsou však neobyčejně nudné, a tak to nemohlo dlouho zůstat.

2. Kde jsme teď

    Zároveň se v 90. letech vyskytly dvě zapadlé práce, které si ušlechtile předsevzaly najít dosud nevyzkoušený zdroj dat, který by šlo k rozřešení vztahů mezi paleognáty použít. Úkol to byl nelehký a nezáviděníhodný, neboť jak výborně shrnul Houde (1988; Houde & Haubold 1987), tou dobou už ornitologové vyčerpali fylogenetický potenciál kostěného patra, křídlových svalů, ramenního i pánevního pletence, mikrovaskularizace kostní tkáně, osteologie kotníku, myologie křídel, ramfotéky, tělních dutin, kardiovaskulární soustavy, pterylografie, opeření mláďat, gonád, spermií, Fabriciovy burzy (pokud jste o takovém orgánu neměli ani ponětí, jsme dva), Eustachovy trubice, kortikální neuroanatomie, karyologie, proteinů vaječného bílku, proteinů oční čočky, chování a parazitů. Přesto se zadařilo: Bock & Bühler (1990)* – mezi autory byl i Walter Bock, který monofylii "ratitů" v 60. letech pomáhal oživit – prozkoumali paleognátí jazylkový aparát, Elżanowski (1995) mozkovnu a patro. Nezávisle na sobě konečně přišli s poslední možnou kombinací, totiž že paleognáti monofyletičtí jsou, ale "běžci" ne.

*Zatímco většina zdrojů cituje tuto studii s rokem 1990, Johnston (2011) s rokem 1988. Snad je to tím, že sympozium, z něhož pochází, se sice skutečně konalo v roce 1988, ale sborník z něj vyšel až o dva roky později. Bock sám, který by to snad měl vědět nejlépe, tuto práci cituje s rokem 1990 (Bock 2003).

    Nikdo z nich své závěry nepodložil numerickou analýzou a mohlo by jít jen o další zajímavý příspěvek do sbírky podivných hypotéz, kdyby si jejich závěry nebyly tak pozoruhodně podobné: jak Bock s Bühlerem, tak Elżanowski dospěli k tomu, že sesterským taxonem vůči všem ostatním paleognátům nejsou tinamy, ale pštrosi (Struthio). Zatímco Bock a Bühler ukázali, že tinamy a nanduové sdílí specifickou stavbu jazylky a přilehlého svalstva, kterou nenajdeme ani u pštrosů, ani nikde jinde (viz níže), což je sice zajímavé, ale ne nutně informativní, Elżanowski zdokumentoval velké množství znaků, v nichž je pštros buďto pleziomorfický, nebo přechodný mezi neognáty a zbývajícími paleognáty. Palatální výběžky předčelistní kosti, které jsou u všech ostatních paleognátů velice výrazné a které se kloubí s kostí radličnou, mají pštrosi menší; postranní výběžek kosti patrové je malý až zakrslý u neognátů, střední u pštrosa a velký u ostatních paleognátů. Prostřední z výběžků maxilly, které se kloubí s kostí patrovou (tzv. maxillopalatinální výběžek), u neognátů a pštrosů odděluje tělo maxilly od kosti radličné, zatímco u nepštrosích paleognátů je zakrslý nebo zcela chybí. Neognáti a pštrosi mají maxillu srostlou s předčelistní kostí, zatímco u jiných "běžců" a tinam jsou obě kosti spojeny jen vazivově. Tento znak je primitivní a neognáti i pštrosi mohli jeho odvozený stav vyvinout nezávisle na sobě, stejně tak je ovšem možné, že jde u nepštrosích paleognátů o odvozený návrat k původnímu stavu a tedy platný sjednocující znak (Elżanowski 1995).
    Zatímco na obě práce bylo rychle zapomenuto a state-of-the-art molekulární studie už se v předních žurnálech přely výhradně o topologii báze "běžců" a pozici ptáků moa (Cooper et al. 2001; Haddrath & Baker 2001), několik molekulárně-biologických laboratoří z celého světa se spojilo pod vedením velkého zastánce "běžčí" monofylie J. Cracrafta, aby předložilo výsledky svých čerstvě dokončených rozborů dosud neanalyzovaných genů (Cracraft et al. 2004). Vynecháme-li z diskuze stromy s velkými polytomiemi, na všech výsledných kladogramech byli přítomní monofyletičtí paleognáti a na většině z nich monofyletičtí "běžci". Na jednom však ne. Konsenzový strom vzešlý z úspornostního bootstrapu 1100 bází jaderného onkogenu c-myc (Cracraft et al. 2004: Figure 27.4) neukazoval "běžce" jako monofyletické – a, co je ze všeho nejzajímavější, u báze paleognátů v této topologii opět stál pštros. 1100 bází je samozřejmě málo oproti studiím založeným na kompletních mitochondriálních genomech (okolo 13 500 bází), ale jaderné geny jsou obecně považovány za spolehlivější pro odkrývání hlubších příbuzenství, jelikož nepodléhají tak rychle saturaci (ztrátě fylogenetického signálu). Navíc šlo už o třetí dataset, který odkryl stejný výsledek, což vyvolává neodbytnou představu sekundárního signálu, skrytého pod nánosem dat podporujících sesterský vztah tinam a monofyletických "běžců". Autoři sami podotkli, že "single gene trees often do not recover ratite monophyly with strong support, although these taxa generally group together" (Cracraft et al. 2004:474).

Hyobranchiální aparát (jazylka) u moa jižního (nahoře) a kiviho (dole). Význam zkratek: (B) basihyale, (Cb) ceratobranchiale, (Eb) epibranchiale, (P) paraglossale, (U) urohyale. Bock & Bühler (1990) zaznamenali v rámci paleognátího jazylkového aparátu značnou variaci. U tinam a nanduů jsou deskovitá paraglossalia navzájem srostlá, zatímco tenké, tyčinkovité basihyale se k nim připojuje skrze masivní šikmý jazylkojazykový sval (musculus hyoglossus obliquus); zatímco pštrosi mají paraglossalia dlouhá, tenká, nesrostlá a široké basihyale se s nimi kloubí přímo svým anterolaterálním povrchem. Šikmý jazylkojazykový sval pštrosům zcela chybí (Bock 2003). Z těchto dat se toho o fylogenezi mnoho nedozvíme bez předpokladů o směru, v němž změny probíhaly; další data však ukázala, že Bock a Bühler se ohledně bazální pozice pštrosů nemýlili. Johnston (2011) např. ukázal, že všechny paleognáty mimo pštrosů a madagaskarských sloních ptáků můžeme sjednotit odvozeným zkrácením epibranchialií. (Modifikováno z Johnston 2011: Figure 2).

    V roce 2006 došlo ke dvěma významným událostem. Grellet-Tinner (2006) našel další ještě neodzkoušený zdroj dat, totiž vejce a vaječnou skořápku. Do své analýzy zahrnul i fosilní taxony a opět mu vyšlo, že "běžci" nejsou monofyletičtí, jelikož jsou mezi ně vnořeny tinamy. Topologie ovšem neměla u báze paleognátího stromu pštrosa a obecně vůbec nepřipomínala nic, co bylo dosud navrženo (viz níže). Podstatnější ale bylo, že se skupina molekulárních fylogenetiků rozhodla, že už by bylo dobré s podobnými problémy a ptačí fylogenezí obecně tak nějak pohnout, a že by bylo zajímavé podívat se, co s ní udělají čtyři miliony nukleotidů (Harshman et al. 2006). Tak se zrodil projekt Early Bird. Své první ovoce přinesl v roce 2008 – přesnější by ale asi bylo napsat, že v roce 2008 do ornitologické systematiky prudce vtrhl a postavil ji na hlavu. Chojnowski et al. (2008) nejprve fylogenetickou analýzou těžkých řetězců klatrinu ukázali, že uvnitř ptáků nemáme žádnou "tvrdou polytomii", kterou by nešlo rozřešit ani se sebevětším množstvím dat, ale že k dosažení správného stromu bude třeba nejméně 32 kilobází převážně intronových, rychle se vyvíjejících sekvencí. O pět měsíců později Hackett et al. (2008) publikovali novou obří ptačí fylogenezi, založenou (jaká to náhoda!) na 32 kilobázích převážně intronových sekvencí. Stejně jako u Chojnowskiho i spol., i zde byli přítomní monofyletičtí paleognáti, ale ne monofyletičtí "běžci" – a i zde se opět jako první od ostatních paleognátů odštěpoval pštros. Hackett et al. (2008) naneštěstí publikovali v Science, a tak byli rádi, že se jim do vyhrazeného 5-stránkového prostoru vůbec vešly všechny grafy a stromky; na nějaké důkladnější prozkoumávání evolučních implikací překvapivého zjištění jaksi nebylo místo.
    To napravili Harshman et al. (2008), kteří si všemožně pohráli s volbou outgroup, fylogenetickými metodami (parsimonie, věrohodnost, Bayes), dělením sekvenčních dat na oddíly podléhající různým substitučním modelům a RY-kódováním (puriny/pyrimidiny místo A/T/C/G). Ze všech analýz jim vylezl silně podpořený klad nepštrosích paleognátů (bootstrap 90–100%, 17 z 20 lokusů existenci kladu podporují pod věrohodností, 15 z 20 pod parsimonií). A nejen to. Ukázali, že tyto výsledky nelze vysvětlit žádným ze známých jevů molekulární evoluce, které zkreslují fylogenetický signál, ale že pouhým artefaktem klidně mohla být podpora pro "běžčí" monofylii v předchozích analýzách. Tinamy totiž po celém svém genomu vykazují výrazně vyšší rychlost molekulární evoluce než všichni ostatní paleognáti. Díky tomu jsou na fylogenetickém stromě reprezentovány dlouhou větví (délka větve udává množství změny na této větvi), a ta má tendenci přitahovat se k dalším dlouhým větvím: každou nukleotidovou pozici mohou obsadit jen 4 báze, a rychle se vyvíjející taxony často náhodně vyvinou stejnou bázi na větším počtu pozic, než v kolika se shodují se svými skutečnými příbuznými. A protože nejdelší větve zpravidla vedou k outgroup, tinamy zákonitě skončily u báze paleognátů, tj. tam, kam je kladla i většina morfologických dat. Jak navíc zdůraznili Phillips et al. (2010), některé analýzy mtDNA se vůbec nenamáhaly "běžčí" monofylii testovat a předem si ji vynutily buď použitím tinam coby outgroup (Cooper et al. 2001), nebo omezením prostoru možných stromů (Paton et al. 2002).
    Harshman et al. (2008) také okamžitě poukázali na to, že pokud je jejich fylogeneze správná, odpadá nutnost slaďovat ji s rozpadem Gondwany. Jsou-li tinamy usazeny uvnitř "běžců", je rozumnější předpokládat, že různí "běžci" schopnost letu nezávisle na sobě ztratili, než to, že ji tinamy vyvinuly nezávisle na všech ostatních ptácích. Tuto druhou hypotézu zastával Oliver (1945), podle nějž jsou tinamy "běžci", kteří se naučili létat ("Tinamous might otherwise be looked upon as Ratite birds which have attained to flight" – Oliver 1945:75), jinak se ale zdá být extrémně nepravděpodobná: zatímco v rámci obratlovců víme o desítkách a (v případě pacifických chřástalů) stovkách nezávislých ztrát aktivního letu, s jistotou známe jen tři jeho zisky (pterosauři, ptáci, letouni). A pokud dokázali bazální zástupci všech velkých skupin paleognátů létat, pak nebyli odkázáni na to, kam je kontinentální drift zanese, ale mohli oceány překonat vlastními silami. Biogeografii ovšem komplikoval i fakt, že Harshman et al. (2008) nedokázali rozhodnout, jak přesně příbuzenské vztahy nepštrosích paleognátů vypadají. Předchozí analýzy (Chojnowski et al. 2008; Hackett et al. 2008) tinamy shodně odkryly coby sesterskou skupinu australasijských běžců (kiviové + kasuárovití), a zatímco Harshmanovi a spol. některé z dílčích analýz vyhazovaly stejný vztah, jiné podporovaly spíše sesterský vztah tinam a nanduů (viz níže).
    Phillips et al. (2010) obdivuhodně důkladně přezkoumali fylogenetický potenciál mitochondriálních dat. Nejprve zohlednili rozdíly mezi sekvencemi kódujícími RNA a mezi sekvencemi kódujícími proteiny, pak rozdělili ty první do oddílů odpovídajících stonkům (stems) a smyčkám (loops) a ty druhé podle kodonových pozic, přičemž pro třetí pozici, v níž je rychlost substituce (a tedy i eroze fylogenetického signálu) největší, využili RY-kódování, díky němuž se pro analýzu stanou viditelné pouze vzácnější transverze (přechody z purinu na pyrimidin a naopak). Každý oddíl dostal samostatný substituční model vybraný Akaikeho informačním kritériem (AIC) a s ním i samostatnou sadu délek větví. Autoři nezapomněli ani otestovat, jak dobře si toto dělení dat vede oproti rozdělením alternativním (třeba jeden model pro každý gen), a zjistili, že jej favorizuje AIC i Bayesův faktor*. Všechna tato fylogenetická magie nakonec opět ukázala pštrosy jako sesterskou skupinu všech ostatních paleognátů, ačkoli ne se zvlášť silnou podporou. Druzí nejbazálnější byli nanduové, zatímco tinamy tvořily mimořádně silně podložený klad s ptáky moa (bootstrap 99%), od nichž už také známe kompletní mtDNA. Klad složený z moa a tinam byl pak sesterským taxonem australasijských běžců tak jako v Hackett et al. (2008); tento výsledek ale opět nebyl příliš robustní vůči bootstrapu. Po odstranění tinam z analýzy však žádný z těchto uzlů nezmizel a podpora jim naopak povyrostla – což ukazuje, že dlouhá větev tinam měla na analýzu rušivý vliv, ale ne dost rušivý na to, aby zkreslila výsledky.

*Bayesův faktor je dalším nástrojem pro volbu modelů a představuje alternativu k tradičním informačním kritériím typu AIC. Ta jsou založena na vzorečku, který porovnává pravděpodobnost dat vzhledem k testovanému modelu s počtem parametrů tohoto modelu. Bayesův faktor je prostý poměr marginálních věrohodností (marginal likelihoods) dvou modelů – parametry modelu "vyintegruje" (marginalizuje). Výsledné číslo není nejvyšší věrohodnost, jaké se dá s modelem dosáhnout, ale průměr přes různé hodnoty jeho parametrů, vážený podle priorního rozdělení těchto parametrů. Lze ukázat, že takový přístup přebytečné parametry penalizuje automaticky. Bayesovský fylogenetik Paul O. Lewis to nádherně předvádí na obrazcích a krychličkách.

    Phillips et al. (2010) nemohli – jak zdůrazňuje nedávná revize ptáků moa (Worthy & Scofield 2012), která se pokoušela jejich hypotézu o sesterském vztahu moa a tinam otestovat morfologickými daty* – zavrhnout ani několik alternativních topologií, v nichž na bázi paleognátů stáli buďto nanduové, klad (nanduové + pštrosi) nebo klad (moa + tinamy). Pštrosa jako nejbazálnějšího paleognáta ale podporují i jaderná data, takže důvěra v tento výsledek je tedy celkem na místě, a autoři se rozhodli prozkoumat i jeho biogeografické důsledky. Tam, kde Harshman a spol. navrhli pouze odpočinout si od spekulací o rozpadu Gondwany, použili Phillips et al. (2010) molekulární hodiny k dataci jednotlivých divergencí. Jejich kalibrační body byly (tak jako celá studie) mimořádně důkladně promyšleny: základem bylo 5 konzervativních externích kalibrací. Interní kalibrace (používající taxon Emuarius pro divergenci emu/kasuár a Diogenornis pro divergenci nanduů od zbytku paleognátů) byly vyzkoušeny, ale analýza se na ně nespoléhala, protože řazení emuára (trochu o něm zde) se zakládá na spekulacích o tom, v čem jsou kasuár a emu pleziomorfičtí, zatímco postavení diogenornise v rámci nanduovitých autoři označili za nejisté – a dobře dělali; nedlouho po publikaci jejich práce ho Alvarenga (2010) na ornitologickém kongresu navrhl přeřadit do kmenové linie kasuárovitých. Ukázalo se, že divergence mezi paleognáty jsou příliš mladé, než aby mohly být vysvětleny rozpadem Gondwany. Pštrosi se např. měli od zbytku paleognátů oddělit před 83 (externí kalibrace) nebo 78 (externí i interní kalibrace) miliony let a podle nejvyššího přijatelného odhadu pak před 103 miliony let, zatímco Afrika se od zbytku Gondwany odtrhla už asi před 110 miliony let. Divergence pštrosů je vlastně jediná, která proběhla ještě před rozpadem jižní Gondwany (tj. Nový Zéland, Antarktida, Austrálie), jímž se obvykle složitě vysvětlují propletené biogeografické historie kiviů, kasuárovitých a ptáků moa – podle Phillipse a spol. však v této době ještě žádný z těchto taxonů neexistoval.

*Skutečně jen "pokoušela". Autoři si po úspornostní analýze pomocí tzv. "backbone constraint" vynutili klad zahrnující moa a tinamy, který nesměl zahrnovat kivie, kasuára, sloní ptáky ani jeden taxon nandua. Poněkud překvapivé potom je, že analýza s předem omezenou topologií "failed to unite tinamous and moa as a clade" (Worthy & Scofield 2012:107). I na stromu vzešlém z omezené analýzy byli "běžci" nadále monofyletičtí a moa měli ke sloním ptákům, kiviům i nanduům blíž než k tinamám.

    Pštrosi tak zřejmě nejsou v Africe původní: dost možná přešli z původní domoviny paleognátů kdesi v Jižní Americe přes pevninský most v oblasti dnešních Antil do Laurasie, odkud do Afriky pronikli až při eurasijsko-africké faunální výměně na přelomu oligocénu a miocénu. Dávalo by to smysl, neboť až do miocénu není v Africe po pštrosech (ani žádných jiných "běžcích") ani stopy. Phillips et al. (2010) si navíc neodpustili ještě jednu analýzu, a to rozbor ancestrálních oblastí výskytu pro jednotlivé uzly paleognátního stromu. V ní byly spočteny pravděpodobnosti s jakou ten který klad vznikl 1) v Africe, jižní Gondwaně, nebo na severní polokouli (pro paleognáty a klad nepštrosích paleognátů), 2) v Jižní Americe, Austrálii, nebo na Novém Zélandu (pro všechny další podskupiny). Autoři vzali v úvahu nejen diogenornisy, ale i "evropského pštrosa" paleotida (Houde & Haubold 1987) a směsku létavých paleognátů litornitidů. Výsledky byly tristní. Klad nepštrosích paleognátů sice vznikl v jižní Gondwaně (a nejspíše na území Jižní Ameriky), ale u paleognátů jako celku už situace tak jistá není a nelze vyloučit, že ikonická "gondwanská" skupina vznikla na severní polokouli, tj. zcela mimo Gondwanu. Maximální věrohodnost tomuto scénaři přiřazuje pravděpodobnost 0,18 a parsimonie jej dokonce preferuje.

Hypotézy o non-monofylií "běžců". (A) Cracraft et al. 2004 – tinamy ponořeny neobvykle hluboko mezi "běžce". (B) Projekt Early Bird. Strom vlevo podpořili Harshman et al. 2008 (20 lokusů, 24 kilobází) s parsimonií a věrohodností s RY-kódováním, strom vpravo pak vyšel Harshmanovi et al. (2008) v bayesovské a normálně kódované věrohodnostní analýze, Hackett et al. 2008 (19 lokusů, 18 totožných, 32 kilobází) a Chojnowski et al. 2008 (2 lokusy, oba shodné s Harshmanem a spol., 3,5 kilobází). (C) Grellet-Tinner 2006 – vejce a vaječná skořápka. Vlevo původní strom, který sice vykazuje non-monofylii "běžců", ale kořen má v neobvyklém místě. Uprostřed tentýž strom "odkořeněný" a s dvěma možnými pozicemi kořene – jednak tou původní, jednak tou mezi pštrosy a zbytkem paleognátů. Vpravo tentýž strom zakořeněný podle druhé varianty. (D) Phillips et a. 2010 (kompletní mtDNA, 14 kilobází). Dataset zahrnoval i ptáky moa a dokonce i krátký úsek (880 bází) od sloních ptáků. Moa se jednoznačně připojili k tinamám a pozice obou skupin dohromady se shodovala s výsledky Hackett et al. (2008), sloní ptáci se zdáli být nejblíže příbuzní kiviům*, avšak nešlo zamítnout ani 4 pozice alternativní (viz stromek). (E) Morfologie: Johnston 2011. Vlevo konsenzus nejúspornějších stromů založených na 47 primárních znacích. Přidání 38 dalších znaků (viz níže) mnoho nezměnilo, pouze seskupilo dohromady moa a kivie. Vpravo většinový konsenzus z 1000 bootstrapových pseudoreplikátů. Větší kompatibilita s výsledky molekulárních studií je vykoupena ztrátou rozlišení. Vytvořeno s nástrojem PhyloPainter (© 2010 Mike Keesey | namesonnodes.org/phylopainter) a s MS Paint, za což se co nejpokorněji omlouvám.

*Příjemně mě překvapilo, když jsem se z vynikajícího článku Mateje Dolinaye dozvěděl, že těchto pár stovek bází není jediným důkazem, který pro případnou bizarní skupinu složenou z miniaturních kiviů a půltunových epyornitidních obrů máme – oba taxony sdílejí podobné proporce kosti kyčelní. Matejův článek ale současně uvádí i podobnosti sloních ptáků a kasuárovitých, což je další vztah, který na základě mtDNA nelze zamítnout.

    Zachránit lákavý scénář paleognátů opouštějící své bratrance na vorech v podobě postupně se odlamujících kontinentů zkusili po Phillipsovi a spol. Johnston (2011) a Allentoft & Rawlence (2011). Johnston vzal data shromážděná Bockem, Bühlerem, Elżanowskim a Grellet-Tinnerem a (na rozdíl od prvních tří) je zahrnul do numerické fylogenetické analýzy. Navíc popsal jazylkový aparát i od těch paleognátů, u nichž příslušná data dosud chyběla, a přidal znaky z prstů na křídlech. Pravda, to vše stále dalo dohromady jen směšných 47 znaků, takže Johnston tento "core dataset" zkusil doplnit osteologickými a myologickými znaky převzatými z několika předchozích studií (čímž se počet znaků vyšplhal na závratných 85). Malý dataset by ještě nebyl žádnou katastrofou – existují i studie, které je v případě morfologických znaků přímo doporučují (Scotland et al. 2003). Horší je Johnstonova metodologie, jíž jsem na blogu pomlouval opakovaně. Autor apriorně rozhodoval, který znakový stav je primitivní a který odvozený, přičemž sám uznal, že takový postup je v dnešní době neobvyklý. Poskytl sice aspoň explicitní a ozdrojovaný seznam předpokladů, které při výběru primitivních stavů použil, ale zde je problematická spíš celá filozofie takového postupu. Proč strom prostě nezakořenit nějakým neognátem? Ten by měl k paleognátům blíž než všechny komponenty Johnstonovy "teoretické outgroup" (Archaeopteryx, bazální maniraptoři, hatérie) a kódovat by jej šlo na všechny znaky současně. No, protože neognáti vykazují skoro v každém znaku stejný stav jako tinamy, a tak "cannot be assumed to place the root in a correct ancestral position" (Johnston 2011:962). Když ale předem víme, jaká pozice kořene je "correct", proč vůbec něco analyzovat?
    Johnstonovi nakonec skutečně vyšlo cosi dost podobného molekulárním fylogenezím, několik rozdílů zde ale bylo. Vztah mezi nanduy (N), tinamami (T) a australasijskými běžci (A) byl odkryt jako (T, (N, A)), což neodpovídá ani jedné z alternativ předložených Harshmanem a spol., tedy buď (N, (T, A)) nebo ((N, T), A). Ptáci moa byli odkryti buď jako sesterská skupina kiviů (85 znaků), nebo v polytomii s kivii a kasuárovitými (47 znaků), což v obou případech odporuje jednomu z nejpevnějších výsledků Phillipse a spol. Sloní ptáci se neukázali vedle kiviů, ale v polytomii s pštrosy a všemi ostatními paleognáty, což Johnstonovi umožnilo vysvětlovat biogeografii paleognátů striktní vikariancí: pokud se madagaskarští sloní ptáci oddělili od zbytku paleognátů jako první (čemuž výše zmíněná polytomie neodporuje), pěkně to sedí s faktem, že z Gondwany se ze všeho nejdřív odštěpil Indo-Madagaskar. Na rozdíl od Phillipse a spol. také u Johnstona novozélandští paleognáti (moa a kiviové) tvoří výlučný klad. To vše ale vyžaduje, aby se společný předek paleognátů v Gondwaně vyskytoval už před 110 miliony let: tehdy nejpozději došlo k separaci Indo-Madagaskaru. To je extrémně spekulativní ze dvou důvodů. Zaprvé, nejstarší fosilní paleognáti jsou známí ze souvrství Hornerstown (Phillips et al. 2010), spadajícího buď do nejpozdnější křídy, nebo nejranějšího paleocénu, tj. do doby asi před 66 miliony let. Johnstonova datace tak vyžaduje 44 milionů let evoluce, která je ve fosilním záznamu naprosto neviditelná – a to jen proto, aby bylo učiněno za dost předpokladu vikariance. Podle Johnstona se navíc paleognáti začali diverzifikovat dříve, než podle dnešního konsenzu vůbec vznikli moderní ptáci jako celek (Brown & van Tuinen 2011; Lindow 2011).
    Podstatně skromnější návrh přednesli Allentoft & Rawlence (2011). Podle nich je možné, že vikariance stála za novozélandským výskytem kiviů a ptáků moa: předci obou skupin sem nemuseli doletět z Antarktidy a Jižní Ameriky, což je jediná možnost, kterou spatřovali Phillips et al. (2010). Své tvrzení zakládají na nedávných počítačových modelech geologických dat, podle nějž sice odtrhávání Nového Zélandu skutečně začlo už před nějakými 85 miliony let, ale na severu nebylo plně hotovo až do doby před 60 nebo 55 miliony let. Protože moa od tinam i kiviové od kasuárovitých se podle Phillipse a spol. oddělili právě před 60 miliony let, není vyloučeno, že předci moa a kiviů ztratili let velice brzy po separaci od svých sesterských taxonů a stihli přejít suchou nohou na Nový Zéland, než jej od Austrálie definitivně odtrhlo Tasmanovo moře. Alespoň pro kivie je taková hypotéza pravděpodobná: parsimonie velí předpokládat, že poslední společný předek kiviů a kasuárovitých už létat neuměl.

3. Acknowledgments

    Děkuji Nicolási Diezovi a Janu Zrzavému za to, že mi umožnili přístup k fulltextu některých zde shrnutých studií – a Nicolási Diezovi dále za to, že jsem se o některých z nich v první řadě vůbec dozvěděl.

Zdroje:

• http://scienceblogs.com/tetrapodzoology/2009/02/14/yes-it-was-a-kiwi/
• http://www.whoi.edu/fileserver.do?id=13263&pt=2&p=13354
• http://evolutionaryvertebratezoology.blogspot.com/.../evolucni-specialisti-na-planete.html
• Allentoft ME, Rawlence NJ 2011 Moa’s Ark or volant ghosts of Gondwana? Insights from nineteen years of ancient DNA research on the extinct moa (Aves: Dinornithiformes) of New Zealand. Ann Anat 194: 36–51
• Alvarenga H 2010 Diogenornis fragilis Alvarenga, 1985, restudied: a South American ratite closely related to Casuariidae. 146 in Miyaki CY, Höfling E, Donatelli RJ, eds. Abstracts XXV Int Orn Congr (Campos de Jordão 2010): recurso eletrônico. Campos do Jordão: IOC
• Barsbold R 1983 [Carnivorous dinosaurs from the Cretaceous of Mongolia.] Trudy Sovm Sov-Mong Paleontol Eksped 19: 5–119 [in Russian – transl. by Siskron C, Welles SP]
• Baumel JJ, Gerchman L 1968 The avian intercarotid anastomosis and its homologue in other vertebrates. Amer J Anat 122: 1–18 
• Beddard FE 1898 The structure and classification of birds. London: Longmans, Green. 548 p
• Beddard FE 1910 On the alimentary tract of certain birds and on the mesenteric relations of the intestinal loops. Proc Zool Soc Lond 1910: 47–93 
• Bock WJ 1963 The cranial evidence for ratite affinities. 39–54 in Sibley CG, Hickey JJ, Hickey MB, eds. Proc XIII Int Orn Congr (Ithaca 1962). Baton Rouge, LA: American Ornithologists' Union
• Bock WJ 2003 Ecological aspects of the evolutionary processes. Zoolog Sci 20(3): 279–89
• Bock WJ, Bühler P 1990 The evolution and biogeographical history of the palaeognathous birds. 31–6 in van den Elzen R, Schuchmann K-L, Schmidt-Koenig K, eds. Current Topics in Avian Biology: Proceedings of the International Centennial Meeting of the Deutsche Ornithologen-Gesellschaft (Bonn 1988). Bonn: Verlag der Deutschen Ornithologen-Gesellschaft
• Bourdon E, de Ricqles A, Cubo J 2009 A new Transantarctic relationship: morphological evidence for a Rheidae-Dromaiidae-Casuariidae clade (Aves, Palaeognathae, Ratitae). Zool J Linn Soc 156(3): 641–63
• Brown JW, van Tuinen M 2011 Evolving perceptions on the antiquity of the modern avian tree. 306–24 in Dyke GJ, Kaiser G, eds. Living Dinosaurs: The Evolutionary History of Modern Birds. London: John Wiley and Sons
• Chiappe LM 2002 Osteology of the flightless Patagopteryx deferrariisi from the Late Cretaceous of Patagonia (Argentina). 281–316 in Chiappe LM, Witmer LM, eds. Mesozoic Birds: Above the Heads of Dinosaurs. Berkeley, CA: Univ of California Press
• Chojnowski JL, Kimball RT, Braun EL 2008 Introns outperform exons in analyses of basal avian phylogeny using clathrin heavy chain genes. Gene 410: 89–96
• Clark HL 1901 The classification of birds. Auk 18: 370–81
• Clarke JA , Norell MA , Dashzeveg D 2005 New avian remains from the Eocene of Mongolia and the phylogenetic position of the Eogruidae (Aves, Gruoidea). Am Mus Novit 3494: 1–17
• Cooper A, Lalueza-Fox C, Anderson S, Rambaut A, Austin J, Ward R 2001 Complete mitochondrial genome sequences of two extinct moas clarify ratite evolution. Nature 409(6821): 704–7
• Cooper A, Mourer-Chauviré C, Chambers GK, von Haeseler A, Wilson AC, Pääbo S 1992 Independent origins of New Zealand moas and kiwis. Proc Natl Acad Sci USA 89(18): 874 l–4
• Cracraft J 1973 Continental drift, paleoclimatology, and the evolution and biogeography of birds. J Zool 169(4): 455–545
• Cracraft J 1974 Phylogeny and evolution of the ratite birds. Ibis 116(4): 494–521
• Cracraft J, Barker FK, Braun M, Harshman J, Dyke GJ, Feinstein J, Stanley S, Cibois A, Schikler P, Beresford P, García-Moreno J, Sorenson MD, Yuri T, Mindell DP 2004 Phylogenetic relationships among modern birds (Neornithes): toward an avian tree of life. 468–89 in Cracraft J, Donoghue M, eds. Assembling the Tree of Life. New York: Oxford Univ Press
• de Beer GR 1956 The evolution of ratites. Bull Br Mus (Nat Hist) 4: 57–70.
• Elżanowski A 1995 Cretaceous birds and avian phylogeny. Cou Forsch-Inst Senck 181: 37–53
• Erickson GM, Rauhut OWM, Zhou Z, Turner AH, Inouye BD, Hu D-Y, Norell MA 2009 Was dinosaurian physiology inherited by birds? Reconciling slow growth in Archaeopteryx. PLoS ONE 4(10): e7390
• Friant M 1968 Sur les ceintures des membres des Oiseaux. Acta Anat 69: 262–73
• Fürbringer M 1888 Untersuchungen zur Morphologie und Systematik der Vögel, zugleich ein Beitrag zur Anatomie der Stütz- und Bewegungsorgane, Volumes 1–2. Amsterdam: Von Holkema. 1751 p
• Gadow H 1893 Vögel. II.—Systematischer Theil. 1–1008 in Bronn HG, ed. Klassen und Ordnungen des Thier-Reichs, vol. 6(4). Leipzig: CF Winter'sche Vertagshandlung
• García-Moreno J, Mindell DP 2000 Rooting a phylogeny with homologous genes on opposite sex chromosomes (gametologs): A case study using avian CHD. Mol Biol Evol 17(12): 1826–32
• Garrod AH 1874 On certain muscles of the thigh of birds and on their value in classification. Part II. Proc Zool Soc Lond 1874: 111–23
• Gill F 2007 Ornithology, 3rd edition. New York: WH Freeman & Co. 758 p
• Glutz von Blotzheim U 1958 Zur Morphologie und Ontogenese von Schultergürtel, Sternum und Becken von Struthio, Rhea, und Dromiceius. Rev Suisse Zool 65(3): 609–772
• Glutz von Blotzheim U 1960 Zur Morphologie und Ontogenese von Schultergürtel, Sternum und Becken von Struthio, Rhea, und Dromiceius. Ein Beitrag zur Phylogenese der Ratiten. 240–51 in Bergman G, Donner KO, von Haartman L, eds. Proc XII Int Orn Congr (Helsinki 1958) Part I. Helsinki: Tilgmannin Kirjapaino
• Grellet-Tinner G 2006 Phylogenetic interpretation of eggs and eggshells: implications for phylogeny of Palaeognathae. Alcheringa 30(1): 141–82
• Groth JG, Barrowclough GF 1999 Basal divergences in birds and the phylogenetic utility of the nuclear RAG-1 gene. Mol Phylogenet Evol 12(2): 115–23
• Gysels H 1970 Some ideas about the phylogenetic relationships of the Tinamiformes, based on protein characters. Acta Zool Pathol Antverp 50: 3–13
• Hackett SJ, Kimball RT, Reddy S, Bowie RC, Braun EL, Braun MJ, Chojnowski JL, Cox WA, Han K, Harshman J, Huddleston CJ, Marks BD, Miglia KJ, Moore WS, Sheldon FH, Steadman DW, Witt CC, Yuri T 2008 A phylogenomic study of birds reveals their evolutionary history. Science 320(5884): 1763–8
• Haddrath O, Baker AJ 2001 Complete mitochondrial DNA genome sequences of extinct birds: ratite phylogenetics and the vicariance biogeography hypothesis. Proc R Soc Lond B 268(1470): 939–45
• Harshman J, Braun EL, Braun MJ, Hackett SJ, Han K-J, Huddleston CJ, Kimball RT, Marks BD, Miglia KJ, Moore WS, Reddy S, Sheldon FH, Steadman D, Yuri T, Witt CC 2006 Early Bird, an international collaboration in deep molecular phylogenetics of birds: can four million bases resolve the tree? J Ornithol 147(Suppl. 1): 42
• Harshman J, Braun EL, Braun MJ, Huddleston CJ, Bowie RCK, Chojnwoski JL, Hackett SJ, Han K-L, Kimball RT, Marks BD, Miglia KJ, Moore WS, Reddy S, Sheldon FH, Steadman DW, Steppan SJ, Witt CC, Yuri T 2008 Phylogenomic evidence for multiple losses of flight in ratite birds. Proc Natl Acad Sci USA 105(36): 13462–7
• Ho CY-K, Prager EM, Wilson AC, Osuga DT, Feeney RE 1976 Penguin evolution: Protein comparisons demonstrate phylogenetic relationships to flying birds. J Mol Evol 8: 271–82
• Holmgren N 1955 Studies on the phylogeny of birds. Acta Zool (Stockholm) 36: 243–328
• Houde P 1988 Palaeognathous birds from the early Tertiary of the Northern Hemisphere. Publ Nuttall Ornithol Club 22: i–vii, 1–148
• Houde P, Haubold H 1987 Palaeotis weigelti restudies: a small Eocene ostrich (Aves: Struthionifomes). Palaeovertebr 17: 27–42
• Huxley TH 1867 On the classification of birds; and on the taxonomic value of the modifications of certain of the cranial bones observable in that class. Proc Zool Soc Lond 1867: 415–72
• Johnston P 2011 New morphological evidence supports congruent phylogenies and Gondwana vicariance for palaeognathous birds. Zool J Linn Soc 163(3): 959–82
• Lindow BEK 2011 Bird evolution across the K–Pg boundary and the basal neornithine diversification. 338–54 in Dyke GJ, Kaiser G, eds. Living Dinosaurs: The Evolutionary History of Modern Birds. London: John Wiley and Sons
• Lowe PR 1935 On the relationship of the Struthiones to the dinosaurs and to the rest of the avian class, with special reference to the position of Archaeopteryx. Ibis 77: 398—432
• Mayr E, Amadon D 1951 A classification of recent birds. Am Mus Novit 1496: 1–42
• McDowell S 1948 The bony palate of birds. Part 1. The Palaeognathae. Auk 65: 520–49
• McFarlane RW 1971 The ultrastructure and phylogenetic significance of avian spermatozoa. Univ of Florida: Unpubl. PhD thesis
• Meise W 1963 Verhalten der straussartigen Vögel und Monophylie der Ratitae. 115–25 in Sibley CG, Hickey JJ, Hickey MB, eds. Proc XIII Int Orn Congr (Ithaca 1962). Baton Rouge, LA: American Ornithologists' Union
• Miller HT, Feeney RE 1964 Immunochemical relationships of proteins of avian egg whites. Arch Biochem Biophys 108: 117–24 
• Mindell DP, Honeycutt RL 1989 Variability in transcribed regions of ribosomal DNA and early divergences in birds. Auk 106(4): 539–48
• Mivart SG 1877 On the axial skeleton of the Struthionidae. Trans Zool Soc Lond 10: 1–52
• Oliver WRB 1945 Avian evolution in New Zealand and Australia. Emu 45: 55–77, 119–52
• Olson SL 1985 The fossil record of birds. 79–238 in Farner DS, King JR, Parkes KC, eds. Avian Biology, Vol. 8. New York: Acad Press
• Osuga DT, Feeney RE 1968 Biochemistry of the egg-white proteins of the ratite group. Arch Biochem Biophys 124: 560–74 
• Owen R 1866 Birds and mammals. On the anatomy of vertebrates, vol. 2. London: Longmans, Green. 592 p
• Parker JJ 1895 On the cranial osteology, classification, and phylogeny of the Dinornithidae. Trans Zool Soc Lond 13: 373–431
• Parker WK 1864 On the osteology of Gallinaceous birds and Tinamous. Trans Zool Soc Lond 5: 149–241 
• Parkes KC, Clark GA 1966 An additional character linking ratites and tinamous and an interpretation of their monophyly. Condor 68(5): 459
• Paton T, Haddrath O, Baker AJ 2002 Complete mitochondrial DNA genome sequences show that modern birds are not descended from transitional shorebirds. Proc R Soc Lond B 269(1493): 839–46
• Phillips MJ, Gibb GC, Crimp EA, Penny D 2010 Tinamous and moa flock together: mitochondrial genome sequence analysis reveals independent losses of flight among ratites. Syst Biol 59(1): 90–107
• Prager EM, Wilson AC 1980 Phylogenetic relationships and rates of evolution in birds. 1209–14 in Nöhring R, ed. Proc XVII Int Orn Congr (Berlin 1978) Part 2. Berlin: Deutschen Ornithologen-Gesellschaft
• Prager EM, Wilson AC, Osuga DT, Feeney RE 1976 Evolution of flightless land birds on southern continents: transferrin comparison shows monophyletic origin of ratites. J Mol Evol 8: 283–94
• Pycraft WP 1900 On the morphology and phylogeny of the Palaeognathae (Ratitae and Crypturi) and Neognathae (Carinatae). Trans Zool Soc Lond 15: 149–290
• Scotland RW, Olmstead RG, Bennett JR 2003 Phylogeny reconstruction: the role of morphology. Syst Biol 52(4): 539–48
• Seebohm H 1888 An attempt to diagnose the suborders of the great Gallino-Gralline group of birds by the aid of osteological characters alone. Ibis 30: 415–35
• Sibley CG 1960 The electrophoretic patterns of avian egg-white proteins as taxonomic characters. Ibis 102: 215–84
• Sibley CG, Ahlquist JE 1972 A comparative study of egg-white proteins of non-passerine birds. Bull Peabody Mus Nat Hist 39: 1–276
• Sibley CG, Ahlquist JE 1981 The phylogeny and relationships of the ratite birds as indicated by DNA-DNA hybridization. 301–35 in Scudder GGE, Reveal JJ, eds. Evolution Today: Proc II Int Congr Syst Evol Biol. Pittsburgh, PA: Hunt Inst Botan Document, Carnegie-Mellon Univ
• Sibley CG, Ahlquist JE 1985 The relationships of some groups of African birds, based on the genetic material, DNA. 115–61 in Schuchmann K-L, ed. Proc Int Symp African Verts. Bonn: Zool Forsch-Inst and Mus A Koenig
• Sibley CG, Ahlquist JE 1990 Phylogeny and classification of birds: a study in molecular evolution. New Haven: Yale Univ Press
• Sibley CG, Ahlquist JE, Monroe BL Jr 1988 A classification of the living birds of the world based on DNA–DNA hybridization studies. Auk 105(3): 409–23
• Sibley CG, Frelin C 1972 The egg white protein evidence for ratite affinities. Ibis 114: 377–87
• Stapel SO, Leunissen JAM, Versteeg M, Wattel J, de Jong WW 1984 Ratites as oldest offshoot of avian stem—evidence from α-crystallin A sequences. Nature 311(5983): 257–9
• Stejneger L 1885 Birds. In Kingsley JS, ed. The standard natural history, vol. 4. Boston: Cassino & Co. 558 p
• Stresemann E 1927—34 Sauropsida: Aves. xi + 899 p in Kükenthal W, Krumbach T, eds. Handbuch der Zoologie 7, Halfte II. Berlin: W. de Gruyter
• Varricchio DJ, Moore JR, Erickson GM, Norell MA, Jackson DF, Borkowski JJ 2008 Avian paternal care had dinosaur origin. Science 322(5909): 1826–8
• Verheyen R 1960 Les tinamous dans les systèmes ornithologiques. Bull Inst Roy Sci Nat Belgique 36(1): 1–11 
• Verheyen R 1961 A new classification for the non-passerine birds of the world. Bull Inst Roy Sci Nat Belgique 37(27): 1–37
• Wetmore A 1930 A classification for the birds of the world. Smithsonian Misc Coll 139: 1–37
• Worthy TH, Scofield RP 2012 Twenty-first century advances in knowledge of the biology of moa (Aves: Dinornithiformes): a new morphological analysis and moa diagnoses revised. New Zealand J Zool 39(2): 87–153

    Pterosaury jsem na blogu dlouho zanedbával, stejně jako přehledy nových abstraktů paleontologických a ornitologických studií – poslední je z konce února. Také zde poslední dobou dominovaly velice dlouhé články, takže je čas na nějaký krátký oddech.

    První z nových studií je na webu dostupná už něco málo přes dva měsíce, ale jelikož je i k dnešnímu datu stále ve fázi online preprintu, doufám, že není pozdě o ní napsat. Zajímavá je spíše z hlediska tafonomie a šlo by říct, že se zabývá bakteriemi právě tolik jako pterosaury. Pinheiro a kolektiv v ní totiž hlásí objev lebky pterosaura z kladu Tapejaridae, který byl blízce příbuzný gigantickým svrchnokřídovým azhdarchidům (je jejich sesterskou skupinou v rámci Azhdarchoidea) a který je charakteristický především bizarně tvarovanými, často velice rozměrnými lebečními hřebeny. Lebka pochází z brazilského souvrství Crato, které patří mezi tzv. Lagerstätten – lokality s vysokou kvalitou prezervace. (Jedním z nejznámějších příkladů je bavorský Solnhofen, který byl po více než jedno století prakticky jediným zdrojem informací o rané evoluci ptáků.) Proto se dochovala nejen kostěná část hřebenu, ale jeho obrys za života zvířete, tj. včetně měkkých tkání, které kost obklopovaly. Nejsou to však samotné měkké tkáně hřebene, které fosilizovaly, ale bakteriální biofilm, který je nahradil. Podle autorů pterosauří mršina klesla na dno laguny, vystlané "kobercem" z bakterií, které se zasloužily o její rozklad. Fosilizace těchto bakterií mohla být hlavní příčinou toho, proč se v Crato tak dobře uchovávají měkké tkáně.

    Druhá práce je rovněž ve fázi "in press", avšak v žurnálu Acta Palaeontologica Polonica, který k takovým studiím umožňuje volný přístup. Hyder a spol. se v ní zabývají ptakoještěřím pánevním pletencem – částí těla, která je naprosto zásadní z hlediska biomechaniky a která nese spousty fylogeneticky informativních znaků, jež jsou však většinou přehlíženy. Důvodem je, že pterosauří pánve byly často nacházeny bez zbytku kostry nebo jen s několika dalšími nediagnostickými kostmi. V posledních letech ale byly popsány pánve i od kompletnějších exemplářů, náležejících k validním, pojmenovaným taxonům, a tím se začaly lepšit i naše znalosti pterosauří pánevní anatomie.
    Autoři zmiňují, že ačkoli máme několik úžasných, trojrozměrně dochovaných pterosauřích pánví, většina je dochována tak, že lze prozkoumat buď jen horní, nebo jen dolní stranu, zatímco nejvíc informací uchovává strana boční. Proto se rozhodli zaměřit jen na kompletní pánve uchované z bočního pohledu. Hyder s kolektivem jednotlivé pánevní morfotypy namapovali na kladogram z popisu darwinoptera (Lü et al. 2009) – ten si vybrali proto, že údajně poskytuje nejspolehlivější fylogenetickou hypotézu o příbuzenstvích v rámci pterosaurů. Na podporu tohoto tvrzení jsou citováni Andres (2007) a Unwin & Lü (2010) – škoda, že první citace odkazuje na ústní prezentaci z konference Flugsaurier, z níž je dostupný už jen abstrakt. (Druhá je pak skoro úplně irelevantní – implikace darwinoptera pro pterosauří fylogenezi zde na dvou stránkách diskutují autoři původního darwinopterova popisu). Osobně mi jako spolehlivější připadají fylogeneze Andrese, který nejprve analyzoval pterodaktyloidy (Andres & Ji 2008), posléze jejich parafyletickou doplňkovou skupinu, "ramforynchoidy" (Andres et al. 2010), aby posléze ve své dizertaci oba datasety spojil do jednoho, doplnil a představil tak vůbec nejrozsáhlejší pterosauří fylogenetickou analýzu vůbec (Andres 2010)*, kterou ve formálně publikované studii nedávno využili Butler et al. (2011). Se 100 ingroup taxony a 183 morfologickými znaky je podstatně rozsáhlejší než dataset Lü'a a spol. (56 ingroup taxonů, 117 znaků). Andres si také dává záležet na sjednocování konfliktních datasetů, takže přebíral znaky jak z Kellnerovy matrice a jejích updatů ze strany Wanga, tak i z matrice Unwina a jejích aktualizovaných verzích od Lü'a. Podle Hydera a spol. však všechny ostatní datasety vyžadují v pánevní anatomii více homoplazií, než je nezbytně nutné, a proto tuto fylogenezi preferují před ostatními.
    Pánevní morfologie příliš nepomáhá s "higher-level relationships", tj. vzájemnými vztahy těch nejrozsáhlejších skupin, poskytuje však pro ně nové diagnostické znaky a tím podporuje jejich monofylii. Nejméně rozdílů lze najít mezi pánvemi ramforynchidů, ktenochasmatoidů a "dsungaripteroidů", což ukazuje, že si všechny tři taxony na rozdíl od jiných skupin uchovaly primitivní, morfologicky generalizovaný stav. (Mimochodem, jméno Dsungaripteroidea může odkazovat buď na úzký klad složený z dsungaripteridů a germanodaktyla [sensu Unwin 2003], nebo široký klad zahrnující dsungaripteridy, azhdarchoidy, nyktosauridy a pteranodontoidy [sensu Kellner 2003]. Hyder a spol. ho používají v prvním významu. Ponaučení: pterosauří systematika je příšerná věc.) Pro další skupiny nelze pánevní apomorfie pro kvalitu materiálu vůbec určit: to se týká anurognátidů, ramforynchidů ze skupiny Scaphognathinae a kladu Campylognathoididae. (Ten je v obvyklém pojetí složen z kampylognátoida a eudimorfodona; podle Andrese [2010] má ale Campylognathoides blíž k pterodaktyloidům a jiným odvozeným pterosaurům než k eudimorfodonovi, což by ze jména Campylognathoididae sensu Unwin [2003] učinilo synonymum Lonchognatha, které by mělo přednost, jelikož bylo publikováno [byť jen o pár stránek ve stejné knize] dřív. A Lonchognatha je vlastně také mladším synonymem Kellnerova Novialoidea. Ponaučení: pterosauří systematika je příšerná, příšerná věc.)
    Snad vůbec nejspecializovanější stavbu pánve měli ornitocheiroidi**, což zřejmě odráží odlišný způsob pohybu. Podle všeho zaujímali na zemi "vztyčenější" polohu než ostatní pterosauři, s tělem orientovaným více horizontálně, a pánev s vzhůru vybíhajícím preacetabulárním výběžkem jim mohla umožnit prodloužení délky kroku a tím i zlepšit pohyb po zemi. Snad šlo o protiváhu k proporčně krátkým zadním končetinám, kterou délku kroku dost limitovaly. Pro ornitocheiroidy to však nebylo velkou vadou; šlo zřejmě o ekvivalent žijících trubkonosých, tj. o letce zvyklé překonávat velké plochy otevřeného oceánu (Unwin 2005; Witton 2008), a podobně jako oni zřejmě nepotřebovali být na pevnině nějak zvlášť obratní. Naopak u azhdarchidů ukazuje velký postacetabulární výběžek (tj. výběžek kosti kyčelní za jamkou kyčelního kloubu) na silnou muskulaturu zadních končetin, která podporuje hypotézu, že azhdarchidi byli do značné míry pozemní zvířata ekologicky ekvivalentní dnešním čápům (Witton & Naish 2008).

Pterosauří pánve namapované na fylogenezi z popisu darwinoptera (Lü et al. 2009), používající rozšířený Unwinův dataset. Podle Hydera a spol. právě tato hypotéza minimalizuje množství homoplazie v pánevních znacích. (Zdroj: Hyder et al. 2012: Figure 2)

*Dizertace sice není volně dostupná, krátké shrnutí, které ale šťastnou shodou okolností ukazuje právě úplný kladogram, už však ano. Kladogram sice zobrazuje jen terminální taxony, Andresovo názvosloví vyšších kladů ale pro změnu přetiskuje anglická wikipedie.

**Už se to skoro neodvažuji podotknout, ale ano, Ornithocheiroidea taky nemá jednoznačný význám a bývá používáno pro několik různých kladů s drasticky odlišným obsahem. Unwin (2003) ho používá pro klad složený z nyktosauridů, istiodaktyla, pteranodona a skupiny Ornithocheiridae. Nejbližší ekvivalent této skupiny na svém stromě Kellner (2003) pojmenoval Pteranodontoidea (podle něj sem ale nepatří nyktosauridi), zatímco Ornithocheiroidea bylo použito pro klad (Pteranodontoidea + (Dsungaripteridae + Azhdarchoidea)). Andres (2010) zde dává za pravdu Kellnerovi: místo Unwinova Ornithocheiroidea používá jméno Pteranodontia, které označuje klad složený jednak z Kellnerových pteranodontoidů, jednak z nyktosauridů, a stejně jako Kellner označuje jménem Ornithocheiroidea i tapejaridy, azhdarchidy a dsungaripteridy, ačkoli vztahy mezi nimi odkrývá úplně jiné. V boční liště blogu jsem Ornithocheiroidea používal sensu Unwin, odteď ho měním na Andresovo Pteranodontia. Ponaučení: ... ne. Raději ne. Bude to tak lepší.

    "Ornitocheiroidní" (sensu Unwin!) pánevní morfologie si ještě celkem dobře rozumí s kladogramy, s nimiž přišli Andres & Ji (2008) a Andres (2010), kde ji lze namapovat na klad Nyctosaurus + Pteranodontoidea (= Pteranodontia sensu Andres), ale ne už s tím, co pomocí Kellnerova datasetu vykryli Wang et al. (2009). Podle jejich rozboru mají pteranodontoidi na stromku blíž k azhdarchoidům a dalším taxonům s "ne-ornitocheiroidní" pánví než k nyktosauridům, jejichž pánev je opět "ornitocheiroidní". Pánevní znaky rovněž podporují sesterský vztah dsungaripteridů s germanodaktylem; podle Wanga a spol. ovšem Germanodactylus coby archeopterodaktyloid stojí někde úplně jinde, což Andres & Ji (2008) i Andres (2010) to potvrzují.
    Dalším problematickým znakem je synsakrum (= struktura vzniklá srůstem křížové kosti s kostmi pánevními; vyskytuje se u pterosaurů, ptáků a několika dalších dinosaurů) se supraneurálním plátem, tedy jakousi plochou deskou, jež vzniká srůstem rozšířených špiček neurálních trnů křížových obratlů skrze zkostnatělé šlachy, které je překrývají. Výskyt supraneurálního plátu na pánvi přesně koreluje s výskytem notaria, tj. srostlých obratlů v oblasti ramenního pletence (ke stejnému srůstu opět došlo konvergentně u ptáků – v obou případech jde zřejmě o zpevnění kostry vyvinuté coby adaptace k letu). Zdá se být fylogeneticky informativní: mají jej dsungaripteroidi sensu Unwin, pteranodonti (= "ornitocheiroidi" sensu Unwin) a neoazhdarchové (Neoazhdarchia je Unwinovo jméno pro klad složený z thalassodromidů a azhdarchidů, který nezahrnuje tapejaridy; novější iterace jeho matrice [Lü et al. 2009] jej však nedokázala odhalit). Autoři konstatují, že "neoazhdarchní" morfologie je na stromech Andrese a Jiho či Wanga a spol. rozptýlena napříč širšími skupinami. Je pravda, že podle Wang et al. (2009) mají thalassodromidi blíž k tapejaridům než k azhdarchidům, takže supraneurální plát by musel tapejaridům chybět druhotně; Lü et al. (2009) však na tom nejsou o nic lépe: u nich thalassodromidi stojí s azhdarchidy a tapejaridy v polytomii, která navíc zahrnuje i rozdrobené chaoyangopteridy. Pro zajímavost dodávám, že Andres (2010) odkryl klad složený z azhdarchidů, thalassodromidů a dsungaripteridů (ti všichni supraneurální plát mají), do něhož ovšem opět patřili chaoyangopteridi (a Eoazhdarcho). K těm se Hyder a spol. skoro nevyjadřují, jedině u shenzhouptera zmiňují, že jeho pánev je rozbitá a nic moc z ní nelze vyčíst. Autoři dále doufají, že pánevní morfologie pomůže stabilizovat obsah Tapejaridae; zatím není jasné, jestli do ní patří ptakoještěři s notarii (pak, pokud spolu výskyt obou struktur opravdu souvisí, by tapejaridi možná mohli mít i supraneurální plát na synsakru; zatím nelze jeho absenci bezpečně potvrdit, protože většina relevantních koster patří nedospělým jedincům a příslušné šlachy osifikují až v dospělosti). Uživatelé Kellnerovy matrice říkají ano, uživatelé Unwinovy ne.
    Podle Hydera a spol. dále existuje pánevní morfotyp charakteristický pro nejbazálnější pterosaury, nazývaný v uvozovkách "dimorfodontidní". Necharakterizuje žádný monofyl; najdeme ho u preondaktyla, peteinosaura, dimorfodona a "kampylognátoididů". Lü et al. (2009), Andres et al. (2010) i Andres (2010) tyto taxony shodně obsazují nejbazálnější pozice na ptakoještěřím fylogenetickém stromě; Wang et al. (2009) tam však místo nich kladou anurognátidy (což je výsledek dost podivný). Zmiňují, že ačkoli nesoulad mezi výskytem různých pánevních morfologií a fylogenezemi odvozenými z Kellnerova či Andresova datasetu lze svést na náchylnost pánevního pletence ke konvergentní evoluci, lepší interpretací prostě je, že pánevní znaky poskytují nezávislou podporu pro fylogenezi Lü'a a spol. Zdůrazňují, že už známe pánve dostatečného množství taxonů, abychom mohli začít zahrnovat pánevní znaky do fylogenetických analýz, což by mohlo pomoci rozřešit některé dlouhotrvající kontroverze. S tím nemůžu než souhlasit: přinejmenším se ukáže, zda jsou pánevní znaky dost silné na to, aby přebily fylogenetický signál v Andresově a/nebo Kellnerově matrici. Zatím mě Hyder a spol. o tom, že Lü et al. (2009) je to nejlepší, s čím pterosauří fylogenetika dosud přišla, příliš nepřesvědčili.

S alternativními fylogenezemi si ptakoještěří panevní morfologie už tak dobře nerozumí. (1) Wang et al. (2009), popis wukongoptera; (2) "Andresova hypotéza", vzniklá propojením výsledků z oddělených studií pterodaktyloidů (Andres & Ji 2008) a "ramforynchoidů" (Andres et al. 2010), které se snažily spojit Kellnerovy a Unwinovy matrice pro dosažení lepších výsledků. (Zdroj: Hyder et al. 2012: Figure 9)

Hyder ES, Witton MP, Martill DM 2012 Evolution of the pterosaur pelvis. Acta Palaeont Pol doi:10.4202/app.2011.1109

Pterosaur pelvic girdles are complex structures that offer a wealth of phylogenetic and biomechanical information, but have been largely overlooked by pterosaur anatomists. Here, we review pterosaur pelvic morphology and find significant differences that correlate well with pterosaur clades identified in some phylogenetic analyses. We find that the length and orientation of the iliac processes, position of the acetabulum, extent of the ischiopubic plate and presence of supraneural fusion in adult individuals are taxonomically informative. Ontogenetic changes in pelvic morphology dictate that osteologically mature specimens are required to assess the development of many of these characteristics. We suggest that pelvic characters can readily be incorporated into pterosaur phylogenetic analyses and may assist in resolving the controversial interrelationships of this group. Distinctive pterosaur pelvic morphotypes suggest considerable differences in stance, locomotory kinematics and hindlimb functionality across the group

Pinheiro FL, Horn BLD, Schultz CL, de Andrade JAFG, Sucerquia PA 2012 Fossilized bacteria in a Cretaceous pterosaur headcrest. Lethaia doi:10.1111/j.1502-3931.2012.00309.x

We report herein the first evidence of bacterial autolithification in the Crato Formation of Araripe Basin, Brazil. The fossilized bacteria are associated with a tapejarid pterosaur skull, replacing the soft-tissue extension of the headcrest. EDS analyses indicate that the bacteria were replaced by phosphate minerals, probably apatite. The bacterial biofilm was likely part of the prokaryotic mat that decomposed the pterosaur carcass at the bottom of the Araripe lagoon. This work suggests that bacterial autolithification could have played a key-role on soft-tissue preservation of Crato Formation Lagerstätte.

Zdroje:

• http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_pterosaur_classifications
• Andres B 2007 Pterosaur systematics. 7 in Hone DWE, ed. Flugsaurier: The Wellnhofer pterosaur meeting, Munich: Abstract Volume. Munich: Bavarian State Collection for Palaeontology
• Andres B 2010 Systematics of the Pterosauria. Yale Univ: Unpubl. PhD Thesis. 366 p
• Andres B, Clark JM, Xu X 2010 A new rhamphorhynchid pterosaur from the Upper Jurassic of Xinjiang, China, and the phylogenetic relationships of basal pterosaurs. J Vert Paleont 30(1): 163–87
• Andres B, Ji Q 2008 A new pterosaur from the Liaoning Province of China, the phylogeny of the Pterodactyloidea, and convergence in their cervical vertebrae. Palaeontology 51(2): 453–69
• Butler RJ, Brusatte SL, Andres B, Benson RBJ 2011 How do geological sampling biases affect studies of morphological evolution in deep time? A case study of pterosaur (Reptilia: Archosauria) disparity. Evolution 66(1): 147–62
• Kellner AWA 2003 Pterosaur phylogeny and comments on the evolutionary history of the group. 105–37 in Buffetaut E, Mazin J-M, eds. Evolution and Palaeobiology of Pterosaurs. Geol Soc Lond Spec Pub 217
• Lü J-C, Unwin DM, Jin X-S, Liu Y-Q, Ji Q 2009 Evidence for modular evolution in a long-tailed pterosaur with a pterodactyloid skull. Proc R Soc B 277(1680): 383–9
• Unwin DM 2003 On the phylogeny and evolutionary history of pterosaurs. 139–90 in Buffetaut E, Mazin J-M, eds. Evolution and Palaeobiology of Pterosaurs. Geol Soc Lond Spec Pub 217
• Unwin DM 2005 The Pterosaurs from Deep Time. New York: Pi Press
• Unwin DM, Lü J-C 2010 Darwinopterus and its implications for pterosaur phylogeny. Acta Geosci Sin 31: 68–9
• Wang X-L, Kellner AWA, Jiang S-X, Meng X 2009 An unusual long-tailed pterosaur with elongated neck from western Liaoning of China. An Acad Bras Ciênc 81(4): 793–812
• Witton MP 2008 A new approach to determining pterosaur body mass and its implications for pterosaur flight. Zitteliana B28: 143–59
• Witton MP, Naish D 2008 A reappraisal of azhdarchid pterosaur functional morphology and paleoecology. PLoS One 3(5): e2271

    Na začátek snad jen krátkou omluvu – poslední dobou jsem na blog psal jen velice zřídka, a to ještě hlavně články o moderních ptácích (tučňáci, papoušci, retropozony,) přestože se mi snad aspoň povedlo dosáhnout vyváženého kompromisu mezi paleontologií a neontologií. Už byl čas na něco neptačího – sepsat tento článek mi ale trvalo dost dlouho, čistě kvůli obrovskému rozsahu studie, jíž se týká.

1. Bazální tetanury se představují

    Naneštěstí jde opět o teropody, byť tentokrát o ty, kteří jsou žijícím opeřencům fylogeneticky a časově docela vzdálení. Na to, že je tato skupina dinosaurů studována snad až příliš, si stěžují i autoři studie, o níž bude dnešní článek:

Certainly the inherently dramatic predatory qualities of these organisms have lent them a special focus, but significant research efforts have also been directed at resolving the problems surrounding bird origins (e.g. Gauthier 1986; Turner et al. 2007). As a result, theropods are probably both oversampled and overstudied relative to other dinosaur groups.

Carrano et al. 2012:211

    Carrano a spol. však zároveň podotýkají, že spousta jednotlivých teropodích taxonů je známa právě tak špatně, jako většina sauropodomorfů nebo ptakopánvých. Velká část výzkumu se totiž soustředí hlavně na teropody velice bazální (jako jsou Herrerasaurus, Eoraptor a jejich příbuzní, kteří jsou v posledních letech popisováni z Jižní Ameriky docela slušným tempem) či naopak na ty, kteří mají nejblíže k ptákům. Pěkně se to projevuje např. ve fylogenetice. Pro celurosaury – skupinu, do které patří ptáci, směska jim podobných taxonů, několik obskurních skupin a vždy populární tyrannosauroidi – existuje standardizovaná datová matrice čítající k dnešku už 374 diskrétních* znaků (Xu et al. 2011; Lee & Worthy 2011), která navíc bývá až několikrát do roka aktualizována a doplňována. Nic takového však neexistuje pro bazální zástupce kladu Tetanurae (zahrnující ptáky a všechno, co k nim má blíž než k ceratosaurům; spadá sem drtivá většina dravých a druhotně nedravých dinosaurů), mezi něž spadá více než 100 forem včetně relativně populárních taxonů typu allosaura, karcharodontosaura, giganotosaurua, megalosaura nebo spinosaura.

To jsou ony, bazální tetanury. Zleva doprava: Eustreptospondylus (dole), Torvosaurus (nahoře), Piatnitzkysaurus, Megalosaurus, Afrovenator (nahoře), Cryolophosaurus (dole vzadu). Krom kryolofosaura jde ve všech případech o zástupce kladu Megalosauroidea, jehož dosud netušenou diverzitu Carrano a spol. pomáhají odkrývat. (Zdroj: ullatchithagaval.com)

1. Co jsou retropozony a k čemu jsou dobré

    O retropozonech jsem na blogu už dvakrát psal v souvislosti s fylogenetikou žijících ptáků. Jde o podtřídu elementů známých jako "skákající geny" (formálně transpozibilní elementy) a i přes minuciózní rozlišování mezi retropozony a retrotranspozony, které někteří autoři obhajují, sem lze zahrnout všechny DNA sekvence, které vznikly reverzní transkripcí mRNA (Zhang et al. 2005). Paradoxní je, že retropozony nikam neskáčou: mohou genom pouze zaplavovat svými kopiemi, nemají ale transpozázu, která by jim umožnila vyříznout se z aktuální pozice a vklouznout jinam. Některé z elementů řazených do této kategorie si umí reverzní transkriptázu kódovat samy: sem spadají třeba LINEs, dlouhé vmezeřené elementy, které zahrnují i tzv. podrodinu CR1 (Chicken Repeats 1), jedny z vůbec nejčastějších ptačích retropozonů. Totéž platí i pro pozůstatky endogenních retrovirů, které ztratily svou infekční schopnost: takovými retropozony jsou LTRs, dlouhé koncové repetice (Ray 2007). Některé elementy z této kategorie ovšem neumějí kódovat ani funkční reverzní transkriptázu a při svém šíření se tak musí spoléhat na jiné skákající geny: to je případ SINEs, krátkých vmezeřených elementů, které se ukázaly být užitečným nástrojem při zkoumání fylogenetických vztahů mezi savci, avšak u ptáků se prakticky nevyskytují.

    Jednou z nejzajímavějších věcí na retropozonech je skutečnost, že vložení každého elementu do genomu provází duplikace cílového místa, přičemž takto vzniklé duplikáty integrovaný retropozon z obou stran olemují (tzv. flanking sequences). Jde o sekvence o délce až stovek nukleotidů a právě díky nim (resp. jejich vysoce konzervovaným regionům) můžeme retropozony identifikovat, a to i velmi, velmi dlouho po samotné inzerci. Waddell et al. (2001) odhadují, že uplyne 250 milionů let, než doklady po inzerci savčího SINE zcela smažou náhodné mutace, a i konzervativnější odhady retropozonům dávají hodně přes 100 milionů let. S takovými časovými intervaly lze nejstarší retropozony bez nadsázky označit za molekulární fosilie, které se z genomu odkrývají právě tak, jako kosti z horniny. Inzerce retropozonů však nejsou něčím, co by se dělo jen daleko v minulosti – dochází k nim jistým tempem neustále. Najdeme-li inzerci tak mladou, že alela, která ji nese, se ještě nestačila zafixovat v populaci (jinak řečeno, v genofondu vedle sebe prozatím koexistuje alela s retropozonem a alela bez retropozonu), může nám toho říct mnoho zajímavého o genetického toku, populační substruktuře, genetické diverzitě nebo míře inbreedingu (Ray 2007). Staré inzerce naopak mohou představovat téměř ideální evidenci o příbuzenských vztazích mezi taxony, a můžeme tak očekávat, že retropozony budou hrát význačnou úlohu v tom, co Joe Felsenstein nazývá "Grand Reunion" – syntézu fylogenetiky a populační genetiky.

Retropozony mohou být užitečné nejen při studiu fylogenetických vztahů mezi vzdálenými taxony, ale i ke sledování populačních změn a diferenciace. Obrázek zachycuje čtyři dceřiné populace vzešlé z jediné populace mateřské, z nichž každá vykazuje vlastní jedinečnou frekvencí výskytu retropozonů na dvou lokusech. Populace zcela vlevo navíc získala zcela novou retropozonovou inzerci na třetím lokusu, která je pro ni unikátní. Takové polymorfické lokusy umožňují identifikovat hybridy nebo stanovit míru genetického toku mezi populacemi. (Zdroj: Ray 2007: Figure 3)

2. Retropozony ve fylogenetice

    K fylogenetické analýze retropozonů stačí většinou obyčejná parsimonie. Evoluce retropozonů je totiž oproti evoluci nukleotidů docela nudná, takže nepotřebujeme všechny ty složité modely s gama-distribuovanou variací v tempu evoluce, proporcemi invariantních pozic atd. Přesto se už objevily návrhy, jak ji modelovat a vyrovnat se s některými z jejich zvláštností: retropozony by se např. mohly do některých lokusů integrovat častěji než do jiných (Han et al. 2011), náhodné mutace by je mohly u různých taxonů zahlazovat různými rychlostmi (Waddell et al. 2001), a inzerce pocházející z multiplikace stejného retropozonu nemají nezávislý výskyt (Miyamoto 1999). Přesto parsimonie i přes své četné chyby (viz zde, zde) stačí, neboť retropozony nejsou jen tak obyčejné znaky. Steel & Penny (2000) ukázali, že mohou-li znaky nabývat dostatečně mnoha stavů, bude parsimonie statisticky konzistentní (= s více daty se bude blížit správnému stromu) pro všechny možné kombinace parametrů – vyhne se tedy i nechvalně proslulému přitahování dlouhých větví ve Felsensteinově zóně. Otázkou je, kolik je "dostatečně mnoho": 4 stavy, které používá většina sekvenčních analýz, rozhodně nestačí, jelikož přitahování dlouhých větví v nich pozorujeme docela běžné. Ale při integraci do ptačího genomu mohou retropozony vklouznout do téměř kterékoli z 1,2 miliard možných pozic, z nichž každá představuje samostatný znakový stav (Matzke et al. 2012). Výjimečnosti retropozonů si v tomto ohledu povšimli jak Steel & Penny (2000), tak Sober (2004) – druhá práce dokonce předem varuje, že při diskuzi o kladech a záporech parsimonie a věrohodnosti bude retropozonové inzerce ignorovat, jelikož obvyklé poučky zde ztrácejí význam. Díky tomu je oprávněné říct, že parsimonie nad retropozonovými daty má stejné vlastnosti jako spolehlivější věrohodnost (Suh et al. 2011a; Matzke et al. 2012).

    Rozbory retropozonových inzercí představují alternativní přístup, jak z DNA dostat fylogeneticky cenné informace. Běžné analýzy, které kódují každý jednotlivý nukleotid samostatně, mají mnohé výhody – téměř neomezený počet znaků s jasně definovanými stavy –, ale také mnoho problémů. Fylogenetický signál může zcela smazat saturace (jev, který nastává, pokud nukleotidová pozice prodělala vícero mutací, než dospěla k nyní pozorovanému stavu), zvláště u rychle se vyvíjejících třetích pozic kodonů; homoplazie v kombinaci s odlišnými rychlostmi evoluce vede k přitahování dlouhých větví, které může svést na scestí každou fylogenetickou metodu (byť některé jsou schopny tuto chybu s více daty napravit); a rizikem je i base composition bias, tedy shlukování taxonů s podobným poměrným zastoupením jednotlivých bází v genomu bez ohledu na reálné příbuzenství.
    Ani jedním z těchto problémů retropozony netrpí. Možnost klasické homoplazie je zde totiž velice omezená: znamenala by buď přesné vyříznutí, nebo nezávislou inzerci stejného typu se stejným zkrácením* a stejnou orientací na totéž místo v genomu. Může se to stát? Ano, může: ukázalo se, že genom má k dispozici mechanizmus pro přesné vystřižení (van de Lagemaat et al. 2005) a že i k paralelní inzerci občas dojde (u ptáků se to zřejmě stalo u sluk a datlů – Han et al. 2011), a nakonec snad přece jen existují tzv. "hot spots", místa, kam se retropozony integrují častěji než jinam (Han et al. 2011). Všechny studie, které se těmito problémy zabývaly, ale došly k závěru, že tyto jevy jsou stále velmi vzácné a nedochází k nim dost často na to, aby představovaly závažný problém (van de Lagemaat et al. 2005; Ray et al. 2006; Ray 2007) – dokonce i Han et al. (2011), kteří toho kolem celé otázky nadělali nejvíc, nakonec uznali, že "TE insertions retain a strong phylogenetic signal and [...] exhibit very little homoplasy" (p. 283), a to navíc jejich metody Matzke et al. (2012) označili za zavádějící a vůči retropozonům neférově tvrdé. Problémy typu přitahování dlouhých větví tedy zcela odpadají. Nemáme navíc důvod předpokládat, že nezávislé inzerce nebo přesné delece dvakrát způsobí přesně ten samý nepravdivý vzorec výskytu. Zdálo by se tedy, že cokoli víc než jedna inzerce se rovná železné jistotě. Waddell et al. (2001) problém uchopili jinak, z hlediska striktně statistického, a zformulovali kritérium ještě tvrdší: k zamítnutí nulové hypotézy jsou třeba aspoň 3 inzerce bez jakéhokoli konfliktního signálu.
    Jediným z velkých problémů sekvenčních dat, kterého se nezbavíme ani u retropozonů, je hemiplazie. Ačkoli stejně jako běžná homoplazie vytváří konfliktní vzorce výskytu znaků, její mechanizmus je odlišný. Je důsledkem jevu známého jako nekompletní třídění linií, který nastává, pokud se ancestrální populace začala štěpit ještě předtím, než se v ní ustálil původní polymorfizmus. Evoluční linie vzešlé z tohoto štěpení zdědí všechny alely obsažené v genofondu původní populace, které se poté zafixují zcela náhodně. O nekompletním třídění linií mluvíme tehdy, když strom sestavený z alel na polymorfickém lokusu (gene tree) nesouhlasí s průběhem fylogeneze (species tree). Často se objevuje při velkých evolučních radiacích, k jaké došlo např. u báze placentálních savců. Právě zde se retropozonové stromy sekly, když Nishihara et al. (2006) odhalili silnou podporu pro klad zahrnující letouny, lichokopytníky, šelmy a luskouny, geniálně pojmenovaný jako Pegasoferae**. Ač podpořen 4 inzercemi, největší sekvenční studie jeho existenci zamítají (Zhou et al. 2011; Meredith et al. 2011). Zároveň jde však o pěknou ukázku toho, že pokud se nám pod rukama plete nekompletní třídění linií, většinou to poznáme: není to totiž tak, že by se všechny genové stromy spikly a společně odporovaly "species tree"; odporují i sobě navzájem. Už Nishihara a spol. si všimli jedné inzerce, jejíž výskyt se s Pegasoferae neslučuje, zato však odpovídá výsledkům sekvenčních analýz. Navíc i samotný výskyt hemiplazie může říct leccos zajímavého o evoluční historii skupiny (Matzke et al. 2012).

*Zkrácení (truncation) poukazuje na skutečnost, že většina inzercí zahrnuje pouze část originální RNA šablony. Důvodem je neúplná reverzní transkripce, která často "vynechává" hlavně u 5' konce původní sekvence (Volff et al. 2001; Han et al. 2011).

**Smím-li citovat z komentáře Mike'a Keeseyho na DML:

What do you call a clade that includes bats, horses, and Ferae (i.e., Carnivora plus whatever it's closest to, in this case pangolins)? Combine the bats and horses into winged horses, and then combine again! I think that's pretty clever.

Retropozonová homoplazie u ptáků podle Hana a spol. (2011). Vpravo jsou zobrazeny fylogenetické stromky vytvořené analýzou nejvyšší věrohodnosti (s bootstrapovými podporami nad 50%), vlevo zarovnané sekvence 4. intronu HMGN2 (a) a 2. intronu GH1 (b). V prvním případě byla zřejmě inzerce retropozonu z rodiny CR1 druhotně ztracena u lenivek (Bucco) a leskovců (Galbula), v tom druhém u "roadrunnera" Geococcyx. U kukalek (Coua) pak došlo k deleci velké části příslušného intronu; retropozon tím byl sice ztracen, nejedná se však o přesné vyříznutí, které jako jediné představuje při rekonstrukci fylogeneze problém. Chyba v topologii je prakticky vyloučena; na monofylii šplhavců (a) a kukaček (b) se shodují data z mtDNA, jaderného genomu, morfologie a dokonce i jiných retropozonů. Konfliktní vzorce výskytu je stále možno vysvětlit hemiplazií, ta se však většinou odehrává na krátkých větvích, zatímco větve vedoucí ke šplhavcům i kukačkám jsou docela dlouhé. (Zdroj: Han et al. 2011: Figure 3)

    Vzhledem k těmto vlastnostem jsou retropozony ideálním nástrojem k nezávislému ověření výsledků sekvenčních analýz. Důležité je zde slovo "nezávislému": není třeba se bát, že sekvenční a retropozonové rozbory využívají dvakrát ta samá data. Ačkoli sekvenční analýza např. jaderných intronů na nějaký ten retropozon pravděpodobně narazí, pořád s ním bude zacházet jen jako s posloupností nezávisle se vyvíjejících nukleotidů. To není špatně: jakmile se retropozon jednou začlení do DNA, skutečně prodělává ty samé náhodné mutace jako každá jiná nekódující DNA; samotná inzerce však představuje proces zcela odlišný. Retropozonová analýza se stará právě jen o tento druhý proces: dokud lze rozpoznat, o jaký typ elementu jde, nejsou bodové mutace v jeho sekvenci důležité. Retropozon zde není kódován jako několik stovek znaků o 4 stavech s nejasnou polaritou, ale jako znak jediný, který se navíc polarizuje zcela sám, bez potřeby nějaké outgroup, takže odvozený stav (přítomnost inzerce) lze od primitivního stavu (absence inzerce) odlišit automaticky.
    Vzhledem k tomu, jak problematické jsou vzájemné příbuzenské vztahy žijících ptáků, není divu, že své naděje do retropozonů začínají vkládat i ornitologové (Livezey 2011; Mayr 2011). První analýzy tohoto typu zde však nastoupily až s určitým zpožděním oproti savcům, a přestože průkopnické studie jsou staré už přes pět let (Watanabe et al. 2006; Kriegs et al. 2007), více se v tomto směru začalo podnikat až zcela nedávno (Suh et al. 2011a; Matzke et al. 2012; Liu et al. 2012). Jednoznačně nejvýznamnější ze všech dosud provedených retropozonových analýz ptáků pak loni publikovali Suh et al. (2011b), jejichž strom přinesl podporu pro nečekaně mnoho skupin již dříve vzešlých z analýz velkého množství sekvenčních dat. Šlo např. o klady Psittacopasserae (složený z papoušků a pěvců) a Eufalconimorphae (papoušci, pěvci, sokoli).
    Zároveň šlo však o ukázku problému, který nedávno zmínil John Harshman v komentáři na Tetrapod Zoology. Retropozonové studie musí být zaměřeny na nějakou konkrétní skupinu či aspoň posloupnost uzlů na kladogramu. Chceme-li znát fylogenetickou pozici pěvců, je nutné zkoumat inzerce sdílené s pěvci. A zatímco analýza takových inzercí dokáže určit relativní fylogenetickou vzdálenost různých skupin od pěvců (papoušci k nim mají nejblíž, sokolovití dál, seriemy ještě dál atd.), vzájemné příbuzenské vztahy čehokoli, co leží mimo tuto páteřní linii – třeba ptáků, kteří tvoří společně samostatný klad a pěvcům jsou tedy vzdálení všichni úplně stejně –, ověřit nemůže. Proto ty rozsáhlé polytomie ve výsledném kladogramu, ve kterých se zcela rozpustila i některá dobře známá a nijak kontroverzní seskupení, jako např. Picocoraciae (šplhavci + "srostloprstí") nebo Strisores (svišťouni + "lelkové"). Není divu: k tomu by byla třeba celá nová sada informativních inzercí, a k tomu je dobré mít osekvenovaný kompletní genom. Ten je zatím k dispozici jen pro kuře (Gallus gallus) a zebřičku pestrou (Taeniopygia guttata) – jenže co když chceme znát příbuzenské vztahy nějakých jiných ptáků?

3. Suh et al. 2012

    Právě na tuto otázku se snaží odpovědět nová studie Alexandera Suha a kolektivu, která byla měsíc zpátky přijata pro publikaci v žurnálu Molecular Biology and Evolution. Autoři připomínají, že ačkoli některé studie zkoumaly retropozony i u ptáků, pro něž ještě není kompletní genom k dispozici (např. Watanabe et al. [2006] u tučňáků), vždy se jednalo jen o několik inzercí, které by rozhodně nestačily k provedení tak rozsáhlé studie, jakou publikovali Suh et al. (2011b). K tomu je potřeba buď získat nové úplné genomy, nebo vynalézt metodu, která dovede retropozony z genomu cíleně vytáhnout. Autoři takovou metodu představili a ihned ji také vyzkoušeli k otestování sesterského vztahu potápek a plameňáků, jedné z nejpozoruhodnějších fylogenetických hypotéz, které se v poslední době u ptáků vyskytly.

Potápka malá, hlavní hvězda nové studie. (Zdroj: birdforum.net, kredit: Nigel Pye)

3.1 Extrakce retropozonů a fylogenetická analýza

    Suh et al. (2012) upravili protokol, který Wang & Kirkness (2005) vytvořili pro populačně-genetickou studii psů založenou na krátkých vmezeřených elementech (SINEs). Jaderná DNA se naštěpí pomocí restrikčního enzymu a podrobí se inverzní polymerázové řetězové reakci (PCR), která jako primery – tedy počáteční místa pro syntézu DNA – používá sekvence typické pro retropozony z rodiny CR1. Elementy z této skupiny tvoří velkou část retropozonů přítomných v ptačím genomu: spolu s dlouhými koncovými repeticemi (LTRs) přes 97% (Suh et al. 2011b). Inverzní PCR umožňuje amplifikaci (tj. zmnožení) i takových úseků DNA, jejichž přesnou sekvenci neznáme, za podmínky, že jsou z obou stran ohraničeny známými sekvencemi (které jsou doplňkové k primerům). Naštěpené fragmenty se při ní nejprve pomocí speciálního enzymu převedou do kruhové formy, která v sobě obsahuje jak známou sekvenci, tak i neznámý úsek, o jehož amplifikaci usilujeme. Následně je aplikován další restrikční enzym, který kruhovou molekulu rozstřihne a znovu ji tak převede do lineární podoby – a protože stříhá uvnitř známé sekvence, nová lineární forma bude obsahovat neznámý fragment ohraničený z obou stran známými sekvencemi, tedy přesně to, čeho jsme se snažili dosáhnout. Na tuto novou lineární molekulu už je pak možné aplikovat běžnou polymerázovou řetězovou reakci. Tímto postupem Suh et al. (2012) vytvořili genomovou knihovnu: soubor mnoha klonovatelných fragmentů DNA (v tomto případě obsahujících CR1 retropozony). Po naklonování a osekvenování už nic nic nebrání tomu, aby se nalezené inzerce využily ve fylogenetické analýze.
    Ukázková studie byla provedena na potápce malé (Tachybaptus ruficollis). Z genomové knihovny sestavené podle výše uvedené procedury Suh et al. (2012) náhodně vybrali 180 klonů fragmentů obsahujících CR1 retropozony a pomocí programu pro zarovnávání (alignment) DNA sekvencí hledali shodu v genomech kuřete a zebřičky. Pokud najde dostatečně vysoký stupeň shody, rozšíří se hledání v obou směrech o další 2 kilobáze. Následuje osekvenování a zarovnání. Pak už nic nebrání tomu, aby byla aplikována přísná kritéria pro identifikaci kandidátních lokusů, která do detailu popsali už Suh et al. (2011b): vhodné jsou jen retropozony z vysoce konzervovaných intronů nebo mezigenových oblastí kratších než 1,5 kilobáze. Těmito požadavky prošlo jen 38 lokusů z původních 180, z nichž dva navíc obsahovaly pouze inzerci sdílenou mezi potápkou a zebřičkou. Jelikož linie vedoucí k zebřičce se už detailní analýzy dočkala (Suh et al. 2011b), autoři tyto dva lokusy vyřadili z další analýzy. Zarovnané sekvence potápky, kuřete a zebřičky se prohledají na zakonzervované oblasti, tedy místa, kde všechny tři genomy vykazují stejnou nebo aspoň velmi podobnou sekvenci. K této sekvenci se vytvoří komplementární primer pro polymerázovou řetězovou reakci. Potřeba je však ještě druhý primer, který ale nemůže být vytvořen na základě stejného postupu: klon fragmentu z genomu potápky obsahuje jen jednu z obou "flanking sequences". Druhý primer je tedy vytvořen čistě na základě předpokladu, že co je stejné u kuřete a zebřičky, bude stejné i u potápek. To je předpoklad docela rozumný (potápky patří do Neognathae, což znamená, že jsou potomky posledního společného předka kuřete a zebřičky), ale občas se samozřejmě sekne: v takových případech navrhují Suh a spol. vytvořit několik alternativních primerů, aby se zvýšila šance dosáhnout s PCR úspěšných výsledků. V tomto konkrétním případě se povedlo najít 15 markerů, které bylo možné osekvenovat napříč taxonomickým vzorkem.
    Z nich Suh et al. (2012) sestavili datovou matrici, v níž je přítomnost retropozonu kódována jako "+" a absence jako "–". Jako OTUs byly použity tři taxony potápek a dvě jejich potenciální sesterské zástupci skupiny. Tou první jsou plameňáci, které v sesterské pozici vůči potápkám odhalují téměř všechna známá data krom některých morfologických znaků (viz níže). Ty jako sesterskou skupinu potápek identifikují morfologicky i ekologicky, pravda, daleko podobnější potáplice (Livezey & Zusi 2007). Daleko zajímavějším fylogenetickým problémem je nicméně hledání sesterské skupiny k celému kladu Mirandornithes, jak skupinu sestávající z potápek a plameňáků pojmenoval Sangster (2005). Brown et al. (2008) a Morgan-Richards et al. (2008) na této pozici odkryli dlouhokřídlé. Obě studie byly založeny na datech z mitochondriální DNA a měly podstatné nedostatky: ta první použila velice rozsáhlý taxonomický vzorek (135 taxonů), ale nekompletní mtDNA sekvence; zatímco ta druhá analyzovala kompletní mt-genomy, avšak u daleko menšího počtu taxonů. Pacheco et al. (2011), kteří zkombinovali to nejlepší z obou studií, přinesli spíše rozporuplné výsledky: v první z dílčích analýz byli sesterským taxonem Mirandornithes opět dlouhokřídlí, ovšem v kombinaci s holuby; v té druhé pak skupina složená z "brodivých", "veslonohých", tučňáků, trubkonosých, potáplic a zcela bizarně i potuů (Nyctibiidae). (Mayr [2011] takové uskupení nazval Aequornithes, potuovité ale v souladu s daty z morfologie i jaderné DNA řadil úplně jinam.) S holuby – resp. s kladem sestávajícím z holubů, mesitů, stepokurů a faetonů – dala mirandornity dohromady také dosud největší studie jaderné DNA (Hackett et al. 2008). Aby otestovali co nejvíce z těchto hypotéz, zařadili Suh et al. (2012) do svého rozboru potáplici, racka a holuba. Škoda je snad jen vynechání mesitů, které coby sesterskou skupinu Mirandornithes ve své vynikající revizi ptačí fylogenetiky navrhl Mayr (2011).

Fylogenetický strom, založený na analýze 15 retropozonových inzercí metodou nejvyšší úspornosti. Tmavošedé kuličky symbolizují fylogeneticky informativní markery odkryté pomocí nové metody; světle šedá kulička nad větví B označuje inzerci objevenou v sekvencích z GenBanku a černá kolečka reprezentují inzerce jedinečné pro daný terminální taxon. Způli vyplněné kolečko označuje dimorfickou (bialelickou) inzerci – v populaci potápky malé se vyskytuje jak alela, která ji nese, tak i alela, která ji postrádá. Hvězdička vyznačuje taxony, pro které přinesla podporu předchozí retropozonová studie zaměřená na větev vedoucí k zebřičce pestré (Suh et al. 2011b). Kladogram vyvrací hypotézu o blízkém příbuzenském vztahu potápek a potáplic, založenou především na pánevní morfologii, a podporuje naopak hypotézu Mirandornithes, podle níž mají ze všech žijících ptáků k potápkám nejblíže plameňáci. Zobrazené taxony jsou (odshora dolů): potápka malá, potápka australská, potápky roháč a žlutorohá, plameňáci, potáplice, racci, holubi, zebřička pestrá a kuře. (Zdroj: Suh et al. 2012: Figure 3)

Fylogram zkonstruovaný metodou nejvyšší věrohodnosti, zobrazující příbuzenské vztahy mezi CR1 elementy přítomnými u potápky malé (tučná písmena na šedém pozadí) a podrodinami stejné skupiny retropozonů známými od kuřete (šedě) a zebřičky malé (černě). Fylogeneze je založena na 0,7 kilobázích z 3’ konce příslušných inzercí a zakořeněna byla podle želví podrodiny CR1 (PSLINE). Zobrazeny jsou bootstrapové podpory nad 50%, 100% hodnoty jsou vyznačené hvězdičkou. (Zdroj: Suh et al. 2012: Figure S2)

3.2 Evoluce retropozonů

    Autoři dělí 15 prozkoumaných inzercí do 4 podrodin podle toho, v jakém období byly aktivní, což koresponduje s tím, na jakém uzlu je odkrývá fylogenetická analýza. Dvě z nich se nacházejí u potápek a plameňáků, avšak u žádného jiného ze zkoumaných ptáků – další důkaz toho, že hypotéza o blízkém příbuzenství potápek a potáplic je chybná a založená pouze na konvergentních podobnostech, vyplývajících ze shodného způsobu plavání pomocí zadních končetin. Podpořena je tím naopak existence kladu Mirandornithes a Mayrovo tvrzení, že sesterský vztah mezi plameňáky a potápkami představuje jeden z nejlépe podložených "kladů vyšší úrovně" v rámci moderních ptáků (Mayr 2004). Jak na DML podotkl David Marjanović, zdá se, že jeden z nejlépe podložených kladů může být klidně přehlížen skoro 250 let: systematiky nikdy nenapadl, dokud jej neodkryli van Tuinen et al. (2001) s kombinovanou analýzou jaderné a mitochondriální DNA. Podpora pro toto seskupení začala rychle vzrůstat, a to jak díky molekulám (Brown et al. 2008; Hackett et al. 2008; Morgan-Richards et al. 2008; Pacheco et al. 2011), tak i dlouho nedoceněným morfologickým datům (Mayr 2004; Manegold 2006), paleontologii (Mayr 2007) nebo parazitologii (Johnson et al. 2006). Nyní se přidávají i retropozony.
    Ze zbylých 13 retropozonů se 3 vyskytují u všech zahrnutých potápek, čímž (statisticky významně) podporují monofylii kladu Podicipediformes. 5 dalších inzercí potvrzuje monofylii kladu Tachybaptus, který zahrnuje jak potápku malou, tak i potápku australskou, v souladu s uznávanou taxonomií potápek (Fjeldså 2004). A konečně posledních pět markerů je autapomorfických pro potápku malou či dokonce nějakou její konkrétní populaci. Jedna z inzercí se dokonce zdá být dimorfická: v genofondu potápek malých je zatím přítomna jak alela s retropozonem, tak i alela bez něj. Jde o vůbec první případ, kdy byla v rámci ptáků zaznamenána retropoziční aktivita specifická pro jediný terminální taxon ("druh"), a o důkaz toho, že by CR1 retropozony mohly být užitečné pro budoucí studie z oblasti populační genetiky (viz výše).
    Studie Suha a spol. je cenná také pro vhled, který vnáší do evoluce samostatných retropozonů. Zajímavá je např. skutečnost, že jedna z inzercí přítomných u všech mirandornitů je blízce příbuzná jednomu podtypu rodiny CR1, který byl zdokumentován u pěvčí linie moderních ptáků (viz obrázek výše). Zatímco v pěvčí linii aktivita této konkrétní skupiny retropozonů končí s neoavianní radiací – období velmi rychlého odštěpování vývojových větví, při kterém vznikly všechny moderní ptačí "řády" mimo hrabavých, vrubozobých a paleognátů a ke kterému zřejmě došlo těsně před koncem křídy –, v linii potápek trvala daleko déle a skončila až s oddělením linie potápek od linie plameňáků před téměř 50 miliony let (Brown & van Tuinen 2011). Suh a spol. uznávají, že se jejich studie zabývala jen malým zlomkem všech CR1 retropozonů obsažených v genomu potápky malé; jejím hlavním cílem však bylo ukázat postup, jakým lze extrahovat retropozony z jakéhokoli ptačího genomu bez nutnosti úplného osekvenování. Metoda podle všeho skutečně funguje: ač autoři tato data neukázali, úspěšně ji dokázali aplikovat i na papouška, sokola a pštrosa emu, aniž by se setkali s nějakým závažným problémem. Postup dále dokáže identifikovat nejen dlouho mrtvé inzerce, jako jsou ty, které sjednocují Mirandornithes (aktivní v raném paleogénu) a Eufalconimorphae (ve svrchní křídě), ale i retropozony aktivní stále nebo aspoň velmi nedávno, jak naznačuje nalezení bialelické inzerce u potápky malé. Cílená extrakce retropozonů pomocí CR1 slibuje odkrýt spoustu markerů potenciálně užitečných pro studium fylogeneze, genomové evoluce a populační genetiky u ptáků a do budoucna snad i jiných skupin.

4. Acknowledgments

    Děkuji Alexanderu Suhovi za to, že mě upozornil na svou novou publikaci, a za ochotu, s níž zodpověděl mé otázky ohledně vlivu homoplazie na retropozonové fylogenetické analýzy – některá z jeho vysvětlení jsem využil i v tomto článku.

Zdroje:

• http://dml.cmnh.org/2011Aug/msg00389.html
• http://blogs.scientificamerican.com/tetrapod-zoology/.../raptor-vs-raptor/#comment-2589
• http://www.natur.cuni.cz/.../bakalarske-prace-jaro-2011/dvorakova/bc-dvorakova.pdf
• http://en.wikipedia.org/wiki/Genomic_library
• http://dml.cmnh.org/2004Feb/msg00055.html
• Brown JW, Rest JS, García-Moreno J, Sorenson MD, Mindell DP 2008 Strong mitochondrial DNA support for a Cretaceous origin of modern avian lineages. BMC Biol 6: 6
• Brown JW, van Tuinen M 2011 Evolving perceptions on the antiquity of the modern avian tree. 306–24 in Dyke GJ, Kaiser G, eds. Living Dinosaurs: The Evolutionary History of Modern Birds. London: John Wiley and Sons
• Fjeldså J 2004 The grebes. New York: Oxford Univ Press.
• Hackett SJ, Kimball RT, Reddy S, Bowie RC, Braun EL, Braun MJ, Chojnowski JL, Cox WA, Han K, Harshman J, Huddleston CJ, Marks BD, Miglia KJ, Moore WS, Sheldon FH, Steadman DW, Witt CC, Yuri T 2008 A phylogenomic study of birds reveals their evolutionary history. Science 320(5884): 1763–8
• Han K-L, Braun EL, Kimball RT, Reddy S, Bowie RCK, Braun MJ, Chojnowski JL, Hackett SJ, Harshman J, Huddleston CJ, Marks BD, Miglia KJ, Moore WS, Sheldon FH, Steadman DW, Witt CC, Yuri T 2011 Are transposable element insertions homoplasy free? An examination using the avian tree of life. Syst Biol 60(3): 375–86
• Johnson KP, Kennedy M, McCracken KG 2006 Reinterpreting the origins of flamingo lice: cospeciation or host-switching? Biol Lett 2(2): 275–8
• Kriegs JO, Matzke A, Churakov G, Kuritzin A, Mayr G, Brosius J, Schmitz J 2007 Waves of genomic hitchhikers shed light on the evolution of gamebirds (Aves: Galliformes). BMC Evol Biol 7: 190
• Liu Z-F, He L-W, Yuan H-G, Yue B-S, Li J 2012 CR1 retroposons provide a new insight into the phylogeny of Phasianidae species (Aves: Galliformes). Gene 502(2): 125–32
• Livezey BC 2011 Progress and obstacles in the phylogenetics of modern birds. 117–45 in Dyke GJ, Kaiser G, eds. Living Dinosaurs: The Evolutionary History of Modern Birds. London: John Wiley and Sons
• Livezey BC, Zusi RL 2007 Higher-order phylogeny of modern birds (Theropoda, Aves: Neornithes) based on comparative anatomy: II. – Analysis and discussion. Zool J Linn Soc 149(1): 1–95
• Manegold A 2006 Two additional synapomorphies of grebes Podicipedidae and flamingos Phoenicopteridae. Acta Ornithol 41(1): 79–82
• Matzke A, Churnakov G, Berkes P, Arms EM, Kelsey D, Brosius J, Kriegs JO, Schmitz J 2012 Retroposon insertion patterns of neoavian birds: strong evidence for an extensive incomplete lineage sorting era. Mol Biol Evol 29(6): 1497–501
• Mayr G 2004 Morphological evidence for sister group relationship between flamingos (Aves: Phoenicopteridae) and grebes (Podicipedidae). Zool J Linn Soc 140(2): 157–69
• Mayr G 2007 The contribution of fossils to the reconstruction of the higher level phylogeny of birds. Spec Phyl Evol 1: 59–64
• Mayr G 2011 Metaves, Mirandornithes, Strisores, and other novelties – a critical review of the higher-level phylogeny of neornithine birds. J Zool Syst Evol Res 49(1): 58–76
• Meredith RW, Janečka JE, Gatesy J, Ryder OA, Fisher CA, Teeling EC, Goodbla A, Eizirik E, Simão TL, Stadler T, Rabosky DL, Honeycutt RL, Flynn JJ, Ingram CM, Steiner C, Williams TL, Robinson TJ, Burk-Herrick A, Westerman M, Ayoub NA, Springer MS, Murphy WJ 2011 Impacts of the Cretaceous Terrestrial Revolution and KPg extinction on mammal diversification. Science 334(6055): 521–4
• Miyamoto MM 1999 Molecular systematics: Perfect SINEs of evolutionary history? Curr Biol 9(21): R816–9
• Morgan-Richards M, Trewick SA, Bartosch-Härlid A, Kardailsky O, Phillips MJ, McLenachan PA, Penny D 2008 Bird evolution: testing the Metaves clade with six new mitochondrial genomes. BMC Evol Biol 8: 20
• Nishihara H, Hasegawa M, Okada N 2006 Pegasoferae, an unexpected mammalian clade revealed by tracking ancient retroposon insertions. Proc Natl Acad Sci USA 103(26): 9929–34
• Pacheco MA, Battistuzzi FU, Lentino M, Aguilar RF, Kumar S, Escalante AA 2011 Evolution of modern birds revealed by mitogenomics: timing the radiation and origin of major orders. Mol Biol Evol 28(6): 1927–42
• Ray DA 2007 SINEs of progress: Mobile element applications to molecular ecology. Mol Ecol 16: 19–33
• Ray DA, Xing J-C, Salem A-H, Batzer MA 2006 SINEs of a nearly perfect character. Syst Biol 55(6): 928–35
• Sangster G 2005 A name for the flamingo-grebe clade. Ibis 147(3): 612–5
• Sober E 2004 The contest between parsimony and likelihood. Syst Biol 53(4): 644–53
• Suh A, Kriegs JO, Brosius J, Schmitz J 2011a Retroposon insertions and the chronology of avian sex chromosome evolution. Mol Biol Evol. 28(11): 2993–7
• Suh A, Kriegs JO, Donnellan S, Brosius J, Schmitz J 2012 A universal method for the study of CR1 retroposons in nonmodel bird genomes. Mol Biol Evol doi:10.1093/molbev/mss124
• Suh A, Paus M, Kiefmann M, Churakov G, Franke FA, Brosius J, Kriegs JO, Schmitz J 2011b Mesozoic retroposons reveal parrots as the closest living relatives of passerine birds. Nature Comms 2: 443
• Steel M, Penny D 2000 Parsimony, likelihood, and the role of models in molecular phylogenetics. Mol Biol Evol 17(6): 839–50
• van de Lagemaat LN, Gagnier L, Medstrand P, Mager DL 2005 Genomic deletions and precise removal of transposable elements mediated by short identical DNA segments in primates. Genome Res 15(9): 1243–9
• van Tuinen M, Butvill DB, Kirsch JAW, Hedges SB 2001 Convergence and divergence in the evolution of aquatic birds. Proc R Soc Lond B 268(1474): 1345–50
• Volff J-N, Hornung U, Schartl M 2001 Fish retroposons related to the Penelope element of Drosophila virilis define a new group of retrotransposable elements. Mol Gen Genom 265(4): 711–20
• Waddell PJ, Kishino H, Ota R 2001 A phylogenetic foundation for comparative mammalian genomics. Genome Inform 12: 141–54
• Wang W, Kirkness EF 2005 Short interspersed elements (SINEs) are a major source of canine genomic diversity. Genome Res 15: 1798–808
• Watanabe M, Nikaido M, Tsuda TT, Inoko H, Mindell DP, Murata K, Okada N 2006 The rise and fall of the CR1 subfamily in the lineage leading to penguins. Gene 365: 57–66
• Zhang Y-J, Wu Y-R, Liu Y-L, Han B 2005 Computational identification of 69 retroposons in Arabidopsis. Plant Physiol 138: 935–48
• Zhou X-M, Xu S-X, Xu J-X, Chen B-Y, Zhou K-Y, Yang G 2011 Phylogenomic analysis resolves the interordinal relationships and rapid diversification of the laurasiatherian mammals. Syst Biol 61(1): 150–64