Omluva č. 1: Blog měl v poslední době extrémně dlouhé prodlevy mezi články. Doufám, že se mi s tím povede něco udělat.

Omluva č. 2: Několik posledních článků (dinosauři v pražské zoo, retropozony a fylogeneze) si pro sebe zabrali žijící ptáci (či jejich prsty) a poměrně technické články o embryologii či molekulární fylogenetice. Tento článek tuto sérii uzavírá, pak přijdou na řadu opět fosilie.

1. Úvod

    O příbuzenských vztazích pěvců k ostatním ptákům jsem psal poměrně nedávno, a to v souvislosti se studií, která se jim snažila přijít na kloub pomocí vzácných genomových změn (Suh et al. 2011). Samozřejmě ale zdaleka nešlo o jediný pokus svého druhu – ve skutečnosti je toto téma v rámci ptačí fylogenetiky jedním z nejvděčnějších. Není divu. Pěvci (Passeriformes) jsou silně odvozená skupina, charakteristická mj. velkými mozky a metabolizmem mimořádně rychlým dokonce i na ptačí poměry. Krom toho se v nich skrývá velká část ptačí diverzity – zahrnují něco přes polovinu žijících ptačích "druhů", byť sčítat taxonomické kategorie (ať už jakékoli) je poměrně neuspokojivý způsob, jak diverzitu kvantifikovat. Mezi pěvce rovněž patří jeden z nejdůležitějších modelových organizmů z řad ptáků, zebřička pestrá (Taeniopygia guttata), která např. pro takovou neurobiologii představuje totéž, co pro embryologii kuře.
    V minulém článku jsem stručně zrekapituloval, co o pozici pěvců říkají genetická data, a zmínil jsem i skutečnost, že s nástupem fylogenomických studií (analyzujících data z více genů současně) vyvstala jakási opatrná shoda. S tou se ale odmítají spokojit Wang et al. (2011), kteří ve své nové studii, nacházející se zatím  v "in press" fázi žurnálu Molecular Biology and Evolution, poukazují na fakt, že ani vztahy podpořené velice rozsáhlými analýzami nejsou zdaleka tak pevné, jak by se mohlo zdát. Příkladem mohou být třeba žebernatky (Ctenophora), na jejichž postavení se neshodnou ani rozsáhlé molekulární datasety. Obecně podobné potíže nastávají v situaci, kdy je taxon, o jehož pozici se zajímáme, součástí nějaké velké vývojové radiace, při níž se vývojové větve štěpily tak rychle, že se na nich nestačily zafixovat žádné významné molekulární a morfologické znaky, podle nichž by dnešní fylogenetici mohli pořadí odštěpování zrekonstruovat. Špatnou zprávou je, že tento popis dokonale sedí na skupinu Neoaves, zahrnující většinu žijících ptáků – včetně pěvců. Wang et al. (2011) tedy navrhují vzít v úvahu všechny dosud navržené hypotézy a otestovat je rozborem nezávislých, dosud nevyzkoušených dat.
    Jaká data by to měla být? Zdá se, že morfologie nám v případě Neoaves moc nepomůže. V předešlých 200 letech k tomu konec konců měla příležitostí víc než dost, a i Livezey & Zusi (2007), kteří přišli s bezprecedentním pokusem analyzovat fylogenetickými metodami téměř 3000 morfologických znaků, stále vykryli některá zdiskreditovaná uskupení, jako např. "klad" složený z potápek a potáplic nebo monofyletické "krátkokřídlé" sensu lato (tj. včetně perepelů – ve skutečnosti odvozených racků – a mesitů, kteří zase zřejmě mají blíž k potápkám a plameňákům). Pak se nabízí možnost použít sekvenční data. Jenže odkud? Stromy odvozené z jednotlivých genů (viz např. četná srovnání v Cracraft et al. 2004) jsou od sebe tak odlišné, že Poe & Chubb (2004) nebyli schopni ani vyvrátit předpoklad, že se každý gen vyvíjel zcela nezávisle na ostatních (což je vedlo k dosti pesimistické hypotéze rozebrané podrobněji v předchozím článku, podle níž nepůjde bazální příbuzenské vztahy Neoaves rozřešit se sebevětším množstvím dat). Chojnowski et al. (2008) ukázali, že to není pravda a že stromky založené na různých lokusech vykazují větší než náhodnou shodu; zároveň také navrhli, že do budoucna bude lepší zaměřit se na rychleji se vyvíjející jaderné introny (tedy nekódující sekvence genů, které se vystřihují z mRNA) a osekvenovat jich tolik, kolik jen bude možné. 16 kilobází je minimum; ideálně by to pak mělo být více než 32 – právě taková přitom byla velikost datové matrice v dosud největší sekvenční fylogenetické analýze ptáků (Hackett et al. 2008).

2. Introny, jejich potenciál, a jak je analyzovat

    Wang et al. (2011) se tedy rozhodli, že nejvhodnějším zdrojem dat k rozřešení fylogenetického postavení pěvců budou jaderné introny. Jenže jejich použití s sebou také nese hned několik problémů: především na tento zdroj dat spoléhaly už předchozí analýzy (Hackett et al. 2008; v menší míře Ericson et al. 2006), jejichž výsledky se nyní mají testovat. Této cirkulárnosti je třeba se nějak vyhnout, ale jedno jednoduché řešení je naštěstí nasnadě: vytvořit zcela nový, nezávislý dataset z dosud neanalyzovaných intronů a pomocí něj tak zatím navržené hypotézy přezkoušet. Další problémy jsou metodologické. Introny se obecně vyvíjejí jednodušším způsobem než exony a nepřekládané oblasti (UTRs, myšlen 5'-konec ["čepička"] a 3'-konec ["ocásek"] molekuly mRNA) a vykazují např. menší rozdíly v substituční rychlosti mezi jednotlivými páry bází kodonu (Bonilla et al. 2011).* Jenže je s nimi také celá řada problémů: např. s "alignmentem", tedy přiřazováním odpovídajících si pozic v sekvencích od různých taxonů. Dalším problémem je substituční saturace, tedy zjednodušeně řečeno ztráta fylogenetické informace způsobená příliš rychlými mutacemi.
    Aby se s těmito problémy vypořádali, vyzkoušeli Wang et al. (2011) několik strategií. Nejdůležitější je hlavně správně přiřadit homologické sekvence, tedy vědět, co se má s čím srovnávat. Autoři se o to pokusili jednak manuálně, jednak k tomu využili specializovaný software. Důkazem, že Wang a spol. mysleli skutečně na vše, je i jejich pojistka proti vlastním biasům, takže před manuálním alignmentem náhodně proházeli taxony a jejich jména skryli za náhodně vygenerované kódy, které nerozlouskli sami, ale přenechali je vlastnoručně napsanému programu. Poté přišli s několika dalšími verzemi, z nichž některé sekvence vyloučili, hlavně pak rozsáhlé inzerce a delece, které nejsou fylogeneticky informativní, a místa, kde jednoznačné přiřazení není možné. Pak si napsali – resp. Edward L. Braun napsal – další program (v jakém zvráceném světě to žijeme: ornitologové programují a programátoři pitvají ptáky), který využili k vyloučení všech nukleotidů, které jsou přítomny jen u dvou či méně taxonů. Stejný postup uplatnili i Hackett et al. (2008). Wang a spol. rovněž zmiňují, že i když má manuální zarovnávání sekvencí své výhody (jelikož lidský mozek aspoň občas dokáže najít mezi dlouhými řadami Áček, Téček, Céček a Géček podobnosti lépe než jednoduchý algoritmus), otevírá prostor různým biasům, které není možné úplně potlačit ani výše zmíněnou rafinovanou metodou; takže krom vlastních mozků zaměstnali ptačími intronovými sekvencemi celkem 6 různých, k tomu určených programů, v nichž si ještě pohráli s různými nastaveními, aby zjistili jejich dopad na výsledky analýzy. Jakmile tedy byly všechny možné variace vhodného uspořádání sekvencí hotové, přišel čas je analyzovat. Ovšem místo toho, aby Wang et al. (2011) prostě jen našli stromek nejlépe odpovídající daným datům, si po analýze vynutili několik stromků s pěvci na určité konkrétní pozici, a teprve potom srovnali, nakolik tyto stromky odpovídají analyzovaným sekvencím. Nejen to, oni postoupili ještě dál a znovu provedli alignment, tentokrát tak, aby co nejlépe odpovídal zadaným stromkům.
    Tím nejtechničtější část studie končí. Zbývá snad jen dodat, že autoři použili bayesovské metody a jejich dataset sestával z 30 lokusů (představujících nějakých 27 kilobází zarovnaných sekvencí) na 17 chromozomech, přičemž ani jeden z nich dosud v žádné fylogenetické studii nebyl použit. Tato data byla získána od 28 ptačích taxonů, záměrně totožných s těmi, které použili Hackett et al. (2008) – přibyl jen nestor kea (Nestor notabilis) a zebřička pestrá (Taeniopygia guttata). Díky tomu bylo v závěru studie možné oba datasety zkombinovat a vytvořit tak "megaset" čítající 49 lokusů a 59 kilobází. Přestože studie se zajímá o fylogenezi poměrně úzkého výseku Neoaves (blízkého příbuzenstva pěvců), hypotézy, které mají být testovány, se absolutně neshodnou, kde se tento výsek nachází. Vybrat outgroup z řad Neoaves tedy nebylo možné: taxony, které by přicházely v úvahu jako rozumní kandidáti v jedné hypotéze (třeba vodní ptáci nebo jeřábi podle Hackett et al. 2008) jsou součástí ingroup v hypotéze druhé (Sibley & Ahlquist 1990). Jako outgroup proto byli nakonec zvoleni dva zástupci prvního kladu, o němž je absolutně jisté, že stojí mimo skupinu tvořenou všemi zahrnutými taxony – čili drůbeže. Konkrétně šlo o čáju obojkovou (Chauna torquata) a kuře (Gallus gallus). Autoři také provedli spoustu testů, které dokazují, že jejich výsledky nijak nezkreslují dobře známé problémy s genetickými daty (base composition bias atd.).

Tři možní kandidáti na nejbližší žijící příbuzné pěvců. Nahoře papoušci, zastoupení nestorem kea (Nestor notabilis); vlevo dole kukačky, na obrázku potom kukačka pokřovní (Cacomantis variolosus); vpravo dole Pici/Piciformes/Picocoraciae, reprezentovaní tukanem obrovským (Ramphastos toco). Hypotézy Sibleyho a Ahlquista i Browna a kolektivu jsem obrázky neilustroval: podle nich je totiž sesterskou skupinou pěvců valná většina nebo dokonce všichni Neoaves, takže by bylo poněkud těžké vybrat reprezentativního zástupce. (Modifikováno z upload.wikimedia.org)

Pět hlavních hypotéz o příbuzenských vztazích pěvců k ostatním ptákům, které byly získány DNA-DNA hybridizací (a) nebo fylogenetickou analýzou morfologických (b), jaderných (c) nebo mitochondriálních (d, e) dat. Zkratky: (CPBT) klad složený z trogonů, šplhavců a parafyletických "srostloprstých"; (PPFC) klad složený ze seriem, sokolovitých, pěvců a papoušků, odpovídající Passerimorphae sensu Boyd (2011). (Zdroj: Wang et al. 2011: Figure 1)

3. Co testovat aneb kdo má k pěvcům nejblíž

    Teď je nutné obrátit se k hypotézám, které mají být otestovány. V minulém článku jsem snad mohl vzbudit mylný dojem, že všechny hypotézy, které stojí za řeč, byly vyprodukovány v posledních 10 letech a opírají se o fylogeneticky analyzovaná sekvenční data. To ale samozřejmě není pravda. První hypotézy o postavení pěvců mezi žijícími ptáky lze vystopovat až ke slavné klasifikaci Huxleyho (1867), který pěvce – v jeho systému nazývané "Coracomorphae" – shrnul dohromady se skupinou tvořenou lelkovitými (Caprimulgidae), kolibříky (Trochilidae) a rorýsovitými (tehdy zvanými Cypselidae). Zajímavé je, že toto uskupení (nazvané Cypselomorphae) bylo na dlouhou dobu pozapomenuto a "lelci" byli spojováni spíš se sovami, ale dnes je zase zpátky a zdá se být jedním z nejlépe podložených příbuzenství v Neoaves.
    Fürbringer (1888) prezentoval podstatně odlišnou hypotézu, a můžeme bez nadsázky říct, že od jeho dob už morfologie s ničím novým nepřišla. Fürbringer svou hypotézu pokrokově zachytil formou stromu (který jsem přetiskl na blogu), na němž měli pěvci nejblíž ke skupině složené z datlů (Picidae), medozvěstek (Indicatoridae), tukanů (Ramphastidae) a "vousákovitých" ("Capitonidae" – umělá skupina parafyletická vůči tukanům). Výslednou skupinu Fürbringer dokonce pojmenoval, a to jako Pico-Passeres. S Fürbringerem souhlasil i Lowe (1946), který dokonce navrhl včlenit čtyři výše uvedené skupiny do pěvců samotných jako "podřád" Pici. Stejnou fylogenetickou hypotézu podpořili i Mayr & Amadon (1951). Nejobvyklejší alternativou byli "srostloprstí" ("Coraciiformes"). Se vzájemným vztahem šplhavců (Piciformes: Pici + Galbulidae + Bucconidae) a "srostloprstých" to bylo vždycky poněkud komplikované: celá řada autorů pokládala leskovce (Galbulidae + Bucconidae) za blíže příbuzné "srostloprstým" (např. Olson 1985), a naopak dudkovité (Lowe 1946) či klad tvořený dudkovitými, dudkovcovitými a zoborožci (Olson 1985) za blízké příbuzné Pici. Dnes se zdá, že "srostloprstí" jsou skutečně parafyletičtí vůči monofyletickým šplhavcům (avšak opačně, než si myslel Olson; zoborožci a dudci k nim naopak mají dál než zbytek skupiny – viz Hackett et al. 2008), a že tedy dohady, zda mají k pěvcům blíž jedni nebo druzí, nemají žádnou cenu. Nicméně hypotézu o tom, že sesterským taxonem k pěvcům jsou pikokoraciani (zoborožci + datli a všechno mezi tím) jako celek, můžeme považovat za dobrý začátek.
    Na konci 60. let a v letech 70. došlo v ptačí systematice ke dvěma významným změnám: nástupu explicitně fylogenetických metod a přesunu od morfologických znaků k molekulárním datům. Tyto dvě novinky se ale dlouho vyvíjely mimoběžně, takže využití parsimonie bylo omezeno na morfologii a molekulární data byla až do 90. let analyzována často sice numerickými, ale relativně primitivními, na distancích založenými metodami typu UPGMA. Snahy analyzovat genetická data distančními metodami vyvrcholily slavnou prací Sibleyho a Ahlquista (1990), která nabízí další hypotézu k otestování. Výše uvedený obrázek ji zachycuje dosti nepřesně, protože zobrazuje jen ty taxony, jejichž pozici testovali také Wang et al. (2011). Sibleyho a Ahlquistovu bichli sice nemám, ale stromek z ní jsem viděl přetištěný v několika jiných publikacích (Cracraft et al. 2004; Livezey & Zusi 2007) a na něm je sesterskou skupinou pěvců klad složený ze většiny tradičních "krátkokřídlých", dále z holubů, dlouhokřídlých, stepokurů, denních dravců ("Falconiformes"), potápek, faetonů, různě rozptýlených "brodivých" a "veslonohých", trubkonosých, tučňáků a potáplic.
    Hypotézy, které vyvstaly, když se ke konci 90. let situace přece jen změnila k lepšímu a i molekulární data se začala analyzovat fylogeneticky, jsem už popsal v minulém článku. Zopakuji tedy jen, že dva největší takové rozbory (Ericson et al. 2006; Hackett et al. 2008) shodně odhalily jako nejbližší žijící pěvců papoušky a jako druhé nejbližší příbuzné sokolovité.
    Výčet zbývá uzavřít s asi posledním z velkých zdrojů dat, totiž s mitochondriální DNA. Ta v 90. letech podporovala dosti neuvěřitelnou hypotézu, podle níž byli právě pěvci – a nikoli paleognáti – sesterskou skupinou ke všem zbývajícím ptákům (Mindell et al. 1997; Härlid & Arnason 1999), což se ukázalo být jen artefaktem přitahování dlouhých větví (viz níže). Od té doby přišla řada důvěryhodnějších mtDNA analýz. Brown et al. (2008) použili neúplné mitochondriální sekvence (4594 párů bází) od úctyhodného množství taxonů (135) a v jejich výsledcích byli pěvci stále pěkně bazální: vyšli jako sesterská skupina všech ostatních neoavianů; bazálnější tedy byla už jen drůbež a paleognáti. To Pratt et al. (2009) použili kompletní mitochondriální genomy (přes 13 kilobází), ale od omezeného počtu taxonů (45). Vyšel jim pro změnu sesterský vztah s kukačkami, který už dříve analýzou mtDNA odkryli Sorenson et al. (2003) a kombinovaným rozborem morfologických znaků a tří jaderných genů Mayr et al. (2003).

4. Psittacopasserae znovu na scéně

    A výsledky? Nic překvapivého. Byly potvrzeny výsledky Hackett et al. (2008), a to nejen v oblasti blízkých pěvčích příbuzných, ale i v topologii "pozemních ptáků" (landbirds – slib napsat o nich něco víc stále trvá...) obecně; jen pozici denních dravců (Accipitriformes) a sov (Strigiformes) nešlo ověřit. Tyto výsledky silně odporují Sibleymu a Ahlquistovi (1990) i topologiím založeným na mtDNA. Livezey & Zusi (2007) se dostali blíž a jejich strom jakousi verzi pozemních ptáků snad i ukazuje; zatímco podle nich ale mezi potomky posledního společného předka sokolovitých a šplhavců patří i Huxleyho cypselomorfové a kukačky, podle Hackett et al. (2008) ani Wang et al. (2011) tomu tak není. Ti druzí dokonce odkryli pozemní ptáky se 100% posteriorní pravděpodobností. Stejná je i pravděpodobnost existence kladu zahrnujícího trogony, zoborožce a dudky (Bucerotes), "jádro srostloprstých" a šplhavce, který rovněž odporuje Livezeyově a Zusiho hypotéze. V ní takový klad zahrnuje ještě pěvce a myšáky.
    Wang et al. (2011) dále potvrdili existenci kladu (seriemy + sokolovití + papoušci + pěvci), který spolu s Boydem (2011) nazývám Passerimorphae, a existenci kladu (papoušci + pěvci), který Suh et al. (2011) nedávno nazvali Psittacopasserae. Ten ovšem nemá nijak vysokou podporu: bootstrapovou jen okolo 30% a posteriorní pravděpodobnost (která je obvykle vyšší než bootstrap, takže podporu trochu "nafukuje") 70%. U podobného typu analýz, který využívá zřetězené sekvence mnoha různých lokusů, ovšem můžeme pravděpodobnost nějaké konkrétní topologie určit i jiným způsobem, a to tak, že se podíváme na to, které geny ji odkrývají a které jí naopak odporují. Tento přístup hojně využíval při svém subjektivním hodnocení dosud provedených analýz např. Mayr (2011). Jeho aplikace na nynější studii ukáže, že z 30 lokusů jich celých 28 vykrylo klady Passerimorphae a Psittacopasserae buď v nejvěrohodnějším stromě (= stromě, který je optimální podle metody maximum likelihood), v bootstrapovém konsenzuálním stromě**, nebo v obou z nich.
    Rozdíl oproti dřívějším analýzám (Hackett et al. 2008; Suh et al. 2011) spočívá hlavně v tom, že sokolovití zde mají blíž seriemám než papouškům a pěvcům; jinak řečeno, nebyl nalezen klad Eufalconimorphae. V tom se naopak – jak podotkl Alexander Suh na DML – shodují s jednou z dílčích analýz Ericsona et al. (2006), v níž autoři strom zakořenili s drůbeží (Galloanserae) namísto paleognátů. Takový výsledek je sice intuitivní (seriema a sokol jsou si asi podobní více, než sokol a kakadu), ale také krajně nedůvěryhodný. Suh et al. (2011) podpořili Eufalconimorphae 7 retropozonovými inzercemi, největším počtem, jaký v jejich analýze nějaký klad obdržel (jinak řečeno, z hlediska retropozonů máme u monofylii eufalkonimorfů víc důkazů, než např. o monofylii pěvců). Po zahrnutí dat z Hackett et al. (2008) se ovšem Eufalconimorphae znovu objevilo; současně také prudce vzrostla podpora pro Psittacopasserae (na téměř 80%).
    Zajímavé také je, že rozdíly v zarovnání sekvencí měly jen velmi malý dopad na výsledky analýzy. Ať už bylo ponecháno původní manuální zarovnání nebo z něj byly odstraněny výše zmíněné problematické úseky, výsledky si stále byly hodně podobné: odstraněné části poskytovaly stejný signál jako ty, které byly ponechány. Stejně tak automaticky vygenerovaná zarovnání stále vyhazovala podobnou topologii, a to s jedinou výjimkou u programu ClustalW2, který je ovšem "known to perform poorly" (Wang et al. 2011:18). Autoři argumentují, že jejich výsledky jednoznačně dokazují, že Chojnowski et al. (2008) měli pravdu, když označili introny za ideální zdroj dat pro fylogenetické analýzy založené na sekvencích, a že výsledky dosud provedených analýz založené na intronech (hlavně pak Hackett et al. 2008) nebyly zkreslené problémy se zarovnáním. Stále ovšem zbývá řada jevů, které mohly výsledky zkreslit, a Wang et al. (2011) se na ně připravili.
    Jedním z nich je nechvalně známé přitahování dlouhých větví (Long Branch Attraction, LBA). Taxony, které se z molekulárního hlediska vyvíjejí rychleji než jiné (= v jejichž genomu častěji dochází k bodovým mutacím), budou na dané pozici sdílet tentýž nukleotid s větší pravděpodobností, než taxony s pomalou molekulární evolucí, a to bez ohledu na to, jaké je jich skutečné příbuzenství. Špatnou zprávou je, že zrovna pěvci dlouhou větev skutečně mají, a jak jsem napsal výše, některé fylogenetické rozbory to dokázalo pěkně zmást. Rozbor Wanga et al. (2011) to ale zřejmě příliš neovlivnilo, jelikož pěvci se zde shlukují s taxony, jejichž rychlost molekulární evoluce je pod mediánem: s papoušky, sokolovitými a seriemami.
    Jelikož si ale autoři chtějí být jistí opravdu vším, prověřili ještě, zda náhodou přitahování dlouhých větví nemůže aspoň za monofylii Psittacopasserae, protože větev papoušků je pořád delší než větev sokolů a seriem. Metod, jak se s LBA vyrovnat, je několik. Může se použít specifický evoluční model***, který tyto rozdíly bere v úvahu. Wang et al. (2011) jeden takový použili a Passerimorphae i Psittacopasserae byly na výsledném stromě stále přítomny. Pokud je to možné, můžeme taky nahradit taxony s dlouhou větví těmi, jejichž molekulární evoluce je pomalejší. Zde to možné bylo: poměrně "pomalí" jsou bazální pěvec pokřovník (Acanthisitta) a bazální zpěvný lyrochvost (Menura), ale nic naplat – i když odstraníme z matice všechny ostatní, rychlejší pěvce, oba taxony se stále sdružují s papoušky a pak se sokolovitými a seriemami. Že by tato klady byla pouhými artefakty, nenaznačil ani test na saturaci: z té bylo v podezření 8 lokusů, jejichž odebrání opět výsledky nijak neovlivnilo. Závěr je jasný: data podporující blízkost papoušků a pěvců nesou pravý fylogenetický signál.

Bayesiánská analýza 30 manuálně zarovnaných jaderných lokusů, používající model CAT-GTR, který by měl být odolný vůči přitahování dlouhých větví. Na stromu jsou dobře patrné klady z Hackett et al. (2008), včetně Psittacopasserae (papoušci + pěvci), Passerimorphae (papoušci + pěvci + sokolovití + seriemy; zde s poněkud neobvyklou vnitřní strukturou) a Picocoraciae (šplhavci a vůči nim parafyletičtí "srostloprstí"). Čísla nad uzly udávají jejich posteriorní pravděpodobnost. (Zdroj: Wang et al. 2011: Figure 3)

5. Myšáci, biogeografický původ pěvců a implikace pro Metaves

    Další zajímavou částí studie je její zjevná neschopnost vypořádat se s myšáky (Coliidae). V článku o retropozonové studii Suha a spol. jsem napsal, že si tento klad "buduje reputaci fylogenetické hádanky srovnatelné i s proslulým hoacinem". Wang et al (2011) tento můj úsudek pouze potvrzují. Vzpomínáte na 2 lokusy, které nepodpořily sesterský vztah mezi pěvci a papoušky? Podle nich byly sesterskou skupinou papoušků myšáci, a teprve potom pěvci. Tento vztah podporuje také morfologie zadních končetin a gen ZENK (Chubb 2004), ostře mu ovšem odporují retropozony (Suh et al. 2011) a dosavadní sekvenční data (Ericson et al. 2006; Hackett et al. 2008). Ostatní geny v datasetu Wanga a spol. myšáky umisťují v sesterském vztahu k trogonům, sokolovitým, pěvcům (14% analýz), nebo psittakopasseranům či passerimorfům jako celku. Po vyloučení myšáků výrazně vzrostla stabilita všech kladů napříč stromem a zvýšila se i bootstrapová podpora passerimorfů a psittakopasseranů. Autoři ale nepovažují situaci z hlediska sekvenčních dat za zcela beznadějnou: problém s myšáky spočívá především v jejich dlouhé větvi, kterou by možná šlo zlomit důkladnějším taxon samplingem: pomoct by mohly třeba sovy (s nimiž se myšáci shlukli v Hackett et al. 2008), které do studie nebyly zahrnuty, jelikož pro příbuzenství pěvců nemají velký význam. Zatím ale nemůže být vyloučena možnost, že myšáci mají blízko k pěvcům – a asi i jakékoli jiné skupině pozemních ptáků.
    Wang et al. (2011) se také zabývají biologickými důsledky sesterského vztahu mezi pěvci a papoušky, především vokálním učením. V této pasáži prakticky do detailů opakují to, co už před nimi na toto téma publikovali Suh et al. (2011): dosud se myslelo, že tuto schopnost nezávisle na sobě vyvinuly tři skupiny ptáků (papoušci, zpěvní pěvci a svišťouni), pod novou hypotézou se ale zdá logičtější, že první dvě ji zdědili od společného předka, což podporují i nedávná zjištění vokálního učení u některých křikavých. Zajímavější je to, co autoři o říkají o biogeografii. Sesterskou skupinou vůči zbytku pěvců (zahrnujícímu jak křikavé [Suboscines], tak zpěvné [Oscines]) jsou pokřovníkovití (Acanthisittidae), drobný, málo prozkoumaný klad špatných letců endemických pro Nový Zéland. Základní dělení papoušků je na klad zahrnující naprostou většinu diverzity celé skupiny, včetně kakaduovitých a arů, a na skupinu Strigopidae (česky zřejmě kakapovití), zahrnující největšího žijícího papouška – nelétavého, silně ohroženého kakapo sovího (Strigops) – a jednoho z nejinteligentnějších známých ptáků s extrémně rozvinutou schopností používat nástroje, nestora kea (Nestor). Zajímavé na nestorovi je ovšem také to, že stejně jako pokřovníkovití pochází z Nového Zélandu: že by právě zde žil společný předek celé skupiny Psittacopasserae? Podle Wanga a spol. je to pravděpodobné, vyloučit ale nelze ani to, že diverzifikace celé skupiny sledovala rozpad Gondwany, jak bylo navrženo např. pro "ratity" (Cracraft 2001; Johnston 2011). Molekulární hodiny se ale takovému scénáři zdají odporovat.
    Poslední příležitost dozvědět se něco víc o příbuzenstvích pozemních ptáků představuje zkombinování původního datasetu se sekvencemi Hackettové a spol. ve stylu "víc genů víc ví". Hlavním cílem autorů bylo posoudit pomocí analýzy "independent evidence" dosavadní hypotézy; není ale bez zajímavosti z toho vzešlý strom srovnat s "total-evidence" stromem, který už nic netestuje, ale má k dispozici ještě nějaká data navíc. Výsledek ale není příliš překvapivý: topologie se přesně shoduje s tím, co odkryli Hackett et al. (2008) – s jedinou výjimkou, a tou je pozice lelků (Strisores). V kladogramu Hackettové a kolektivu jsou tito součástí Metaves, kontroverzního kladu, který navzdory tomu, že je založen doslova na pár desítkách nukleotidů v jediném intronu jediného jaderného genu, představuje zřejmě nejlepší hypotézu o bazálních divergencích Neoaves, jakou máme k dispozici. Odkryly ji totiž dvě dosud nejobsáhlejší molekulární analýzy (Ericson et al. 2006; Hackett et al. 2008) a žádná ji explicitně nevyvrátila, včetně té retropozonové (Suh et al. 2011). Jenže zatímco podle ní patří lelkové do Metaves a jeřábi, chřástalové či kukačky naopak spolu s pozemními ptáky do Coronaves, Wang a spol. odkryli klad složený z pozemních ptáků a lelků, který kukačky ani monofyletické jádro "krátkokřídlých" nezahrnuje.
    Co tohle všechno znamená? Dost možná vůbec nic, jelikož analýze o podobné otázky vůbec nejde a spousta relevantních taxonů chybí, protože nám neříkají nic zajímavého o pozici pěvců (potáplice, dlouhokřídlí, dropové, holubi, stepokurové, svišťouni, mirandorniti a konec konců i spousta pozemních ptáků). Na druhou stranu ale zatím zdaleka nejobsáhlejší molekulární datová matrice vyprodukovala kladogram, který s hypotézou Metaves prostě nelze sloučit. Co se zbytku analýzy týče, klady Passerimorphae a (Picocoraciae + trogoni) mají ještě vyšší podporu než v Hackett et al. (83% a 79% vs. 64% a 71%), zatímco podpora Psittacopasserae zůstává stejná (78% vs. 77%). Důvodem jsou zřejmě opět zlotřilí myšáci. Ani kladogram vzešlý z kombinovaného datasetu nejeví známky přitahování dlouhých větví.

Věrohodnostní (maximum likelihood) analýza datasetu sestávajícího z 49 lokusů, vzniklého sloučením dat z Wang et al. (2011) a Hackett et al. (2008), s myšáky (a) bez nich (b). Čísla nad uzly udávají bootstrapovou podporu; patrné je, že na stromku zahrnujícím myšáky jsou u významných kladů (Psittacopasserae, Passerimorphae, Picocoraciae + trogoni) podstatně menší. Hvězdička označuje 100% podporu. (Zdroj: Wang et al. 2011: Figure 4)

    Celkově lze říct, že Wang et al. (2011) ukázali 1), které klady podpořené Hackettovou a kolektivem jsou nejpevnější a které si zaslouží další výzkum (byť bych si dovolil dodat, že vztahy mezi psittakopasserany, sokolovitými a seriemami asi nebudou tak problematické, jak autoři naznačují; 7 retropozonů je prostě hodně); 2) že studie a publikace, které zacházejí se stromkem z Hackett et al. pomalu jako se zjevenou pravdou (Hieronymus & Witmer 2010; Braun et al. 2011; Dyke & Kaiser 2011), což je přístup, který ornitologie zažila naposledy s tapisérií Sibleyho a Ahlquista, vzhledem k současnému stavu znalostí dobře dělají; 3) že Neoaves skutečně nejsou tvrdou polytomií, ale že i tuto mimořádně rychlou radiaci se povede s dostatečným množstvím molekulárních dat rozřešit. Takže nakonec docela optimistické zprávy.

6. Acknowledgments

Za zaslání fulltextu studie děkuji Alexanderu Suhovi a Janu Zrzavému.


*Každý kodon se skládá ze tří párů bází. V tom 3. dochází téměř vždy k substituci – změně "písmena" – častěji než v 1. a v 1. častěji než v 2. Pokud analýza tyto rozdíly nezapočítá, může podávat zkreslené výsledky: třetí kodon je např. vhodný k rekonstrukci mělkých vztahů (tedy těch, kde je společný předek analyzovaných taxonů poměrně nedávný), které nezasahují hluboko do minulosti; ale může podávat zavádějící výsledky u vztahů hlubokých.

**Neparametrický bootstrap je statistický test robustnosti výsledků analýzy. Jeho fylogenetická implementace v zásadě tahá z původního datasetu s opakováním, dokud nevytvoří nový dataset stejné velikosti ("pseudoreplikát"), v němž některé z původních znaků chybějí a jiné jsou zahrnuty vícekrát. Pro každý z množství pseudoreplikátů potom odhadne nový strom. Můžeme se buď dívat na to, v kolika takových stromech se vyskytuje uzel, jehož podporu testujeme, nebo z těchto stromků můžeme sestrojit strom konsenzuální, který může suplovat strom vytvořený na základě kompletní matrice. Velmi hezky popsáno zde.

***Evoluční model je (v tomto smyslu) popisem procesu nukleotidových substitucí – procesu nahrazování různých bází v DNA různými bázemi jinými. Každý aspekt substitučního procesu (např. rovnovážná četnost určité báze nebo relativní rychlost přechodu mezi danými dvěma bázemi) je v modelu reprezentován parametrem, jehož hodnotu analýza odhaduje spolu s tvarem stromu (topologií) a délkami větví (které udávají střední hodnotu počtu změn, k nimž na té které větvi došlo).

Zdroje:

• http://dml.cmnh.org/2011Sep/msg00378.html
• Bonilla AJ, Braun EL, Kimball RT 2010 Comparative molecular evolution and phylogenetic utility of 3’-UTRs and introns in Galliformes. Mol Phylogenet Evol 56(2): 536–42
• Boyd JH III 2011 Taxonomy in Flux Checklist 2.52: Tree View. Accessed September 13, 2011 at http://jboyd.net/Taxo/tree_aves.html
• Braun EL, Kimball RT, Han K-L, Iuhasz-Velez NR, Bonilla AJ, Chojnowski JL, Smith JV, Bowie RCK, Braun MJ, Hackett SJ, Harshman J, Huddleston CJ, Marks BD, Miglia KJ, Moore WS, Reddy S, Sheldon FH, Witt CC, Yuri T 2011 Homoplastic microinversions and the avian tree of life. BMC Evol Biol 11: 141
• Brown JW, Rest JS, García-Moreno J, Sorenson MD, Mindell DP 2008 Strong mitochondrial DNA support for a Cretaceous origin of modern avian lineages. BMC Biol 6: 6
• Chojnowski JL, Kimball RT, Braun EL 2008 Introns outperform exons in analyses of basal avian phylogeny using clathrin heavy chain genes. Gene 410: 89–96
• Chubb AL 2004 New nuclear evidence for the oldest divergence among neognath birds: the phylogenetic utility of ZENK (i). Mol Phylog Evol 30(1): 140–51
• Cracraft J 2001 Avian evolution, Gondwana biogeography, and the Cretaceous-Tertiary mass extinction event. Proc R Soc B 268(1466): 459–69
• Cracraft J, Barker FK, Braun M, Harshman J, Dyke GJ, Feinstein J, Stanley S, Cibois A, Schikler P, Beresford P, García-Moreno J, Sorenson MD, Yuri T, Mindell DP 2004 Phylogenetic relationships among modern birds (Neornithes): toward an avian tree of life. 468–89 in Cracraft J, Donoghue M, eds. Assembling the Tree of Life. New York: Oxford Univ Press
• Dyke G, Kaiser G, eds, 2011 Living Dinosaurs: The Evolutionary History of Modern Birds. Oxford: Wiley-Blackwell
• Ericson PGP, Anderson CL, Britton T, Elżanowski A, Johansson US, Källersjö M, Ohlson JI, Parsons TJ, Zuccon D, Mayr G 2006 Diversification of Neoaves: Integration of molecular sequence data and fossils. Biol Lett 2(4): 543–7
• Fürbringer M 1888 Untersuchungen zur Morphologie und Systematik der Vögel, zugleich ein Beitrag zur Anatomie der Stütz- und Bewegungsorgane, Volumes 1–2. Amsterdam: Von Holkema. 1751 p
• Hackett SJ, Kimball RT, Reddy S, Bowie RC, Braun EL, Braun MJ, Chojnowski JL, Cox WA, Han K, Harshman J, Huddleston CJ, Marks BD, Miglia KJ, Moore WS, Sheldon FH, Steadman DW, Witt CC, Yuri T 2008 A phylogenomic study of birds reveals their evolutionary history. Science 320(5884): 1763–8
• Härlid A, Arnason U 1999 Analyses of mitochondrial DNA nest ratite birds within the Neognathae: supporting a neotenous origin of ratite morphological characters. Proc R Soc B 266(1416): 305–9
• Hieronymus TL, Witmer LM 2010 Homology and evolution of avian compound rhamphothecae. Auk 127(3): 590–604
• Huxley TH 1867 On the classification of birds; and on the taxonomic value of the modifications of certain of the cranial bones observable in that class. Proc Zool Soc Lond 1867: 415–72
• Johnston P 2011 New morphological evidence supports congruent phylogenies and Gondwana vicariance for palaeognathous birds. Zool J Linn Soc doi:10.1111/j.1096-3642.2011.00730.x
• Livezey BC, Zusi RL 2007 Higher-order phylogeny of modern birds (Theropoda, Aves: Neornithes) based on comparative anatomy: II. – Analysis and discussion. Zool J Linn Soc 149(1): 1–95
• Lowe PR 1946 On the systematic position of the woodpeckers (Pici), honey-guides (Indicator), hoopoes and others. Ibis 88: 103–26
• Mayr E, Amadon D 1951 A classification of recent birds. Am Mus Novit 1496: 1–42
• Mayr G 2011 Metaves, Mirandornithes, Strisores and other novelties – a critical review of the higher-level phylogeny of neornithine birds. J Zool Syst Evol Res 49(1): 58–76
• Mayr G, Manegold A, Johansson US 2003 Monophyletic groups within ‘higher land birds’ – comparison of morphological and molecular data. J Zool Syst Evol Res 41: 233–48
• Mindell DP, Sorenson MD, Huddleston CJ, Miranda HC Jr, Knight A, Sawchuk SJ, Yuri T 1997 Phylogenetic relationships among and within select avian orders based on mitochondrial DNA. 213–47 in Mindell DP, ed. Avian molecular evolution and systematics. San Diego: Acad Press
• Olson SL 1985 The fossil record of birds. 79–238 in Farner DS, King JR, Parkes KC, eds, Avian biology, Vol. 8. New York: Acad Press
• Poe S, Chubb AL 2004 Birds in a bush: five genes indicate explosive evolution of avian orders. Evolution 58(2): 404–15
• Pratt RC, Gibb GC, Morgan-Richards M, Phillips MJ, Hendy MD, Penny D 2009 Toward resolving deep Neoaves phylogeny: data, signal enhancement, and priors. Mol Biol Evol 26: 313–26
• Sibley CG, Ahlquist JE 1990 Phylogeny and classification of birds. New Haven, CT: Yale Univ Press
• Sorenson MD, Oneal E, García-Moreno J, Mindell DP 2003 More taxa, more characters: the hoatzin problem is still unresolved. Mol Biol Evol 20: 1484–98
• Suh A, Paus M, Kiefmann M, Churakov G, Franke FA, Brosius J, Kriegs JO, Schmitz J 2011 Mesozoic retroposons reveal parrots as the closest living relatives of passerine birds. Nature Comms doi:10.1038/ncomms1448
• Wang N, Braun EL, Kimball RT 2011 Testing hypotheses about the sister group of the Passeriformes using an independent 30 locus dataset. Mol Biol Evol doi: 10.1093/molbev/msr230

1. Dlouhý, táhlý úvod

Začněme zeširoka.

    Přestože má hypotéza, podle níž jsou ptáci malí, agilní teropodní dinosauři, kteří přežili katastrofu na přelomu křídy a paleogénu, ohromnou vysvětlovací schopnost a od jejího vzkříšení v 70. letech minulého století ji podpořilo ohromné množství důkazů, setkala se s několika tvrdými oříšky. Některé z nich byly vyřešeny tak, jak se paleontologické problémy vyřeší většinou (novými fosiliemi), o jednom se ale vedou rozsáhlé diskuze dodnes. Mám na mysli slavný "problém homologie prstů".

    Na křídlech skoro všech ptáků najdeme tři prsty. Jelikož je však ptačí ruka vysoce odvozená (čili divná), bylo překvapivě komplikované určit, které prsty to vlastně jsou. Až v 50. letech 20. století se došlo k závěru, že jde o prsty 2, 3, 4, čili o homology lidského ukazováku, prostředníku a prsteníku. Ovšem už u těch nejranějších dinosaurů, jako jsou Eoraptor a Herrerasaurus, je jasně patrná redukce čtvrtého a pátého prstu: z pátého zbyla v podstatě obnažená záprstní kost bez prstních článků a čtvrtý prst si udržel prstní článek jeden, dosti rudimentární (Langer 2004). Čtvrtý prst se v teropodní evoluci ještě nějakou dobu udržel, a jeho poslední zbytek – holý metakarpál, neboli záprstní kost – zmizel u samé báze kladu Coelurosauria (který zahrnuje ptáky, nejrůznější "raptory", lenochodovité terizinosaury, pštrosovité dinosaury a tyrannosauroidy). To neponechává příliš prostoru nejasnostem: jsou-li ptáci odvození teropodi, pak jejich tři prsty musí být I, II, III. Embryologie a paleontologie tady, zdá se, dospěly k neřešitelnému konfliktu, na němž si neváhali přihřát polívčičku notoričtí popírači dinosauřího původu ptáků. Jejich alternativa, tj. vývoj z neurčitých triasových archosauromorfů, takovým problémem netrpí; i přes chronickou neschopnost BANDitů říct cokoli bližšího o vlastních kandidátech na ptačí předky je totiž jasné, že zvířata to byla bezesporu primitivně pětiprstá.

  Otázka, jak se vůbec zárodečné kondenzace povedlo identifikovat, je poměrně komplikovaná a souvisí i s takovými problémy, jako je původ tetrapodů, resp. jak poznat, kterým kostem v ploutvích "svaloploutvých ryb" jsou kosti tetrapodní končetiny homologické. Zatímco obdobu tetrapodní kosti pažní, loketní a vřetenní najdeme i v "rybí" ploutvi velmi snadno, čím víc postupujeme distálně (tedy směrem od trupu), tím víc se věci komplikují. Tam, kde jsou kosti tetrapodů hezky uspořádané do několika pásů (tvořených postupně proximálními a distálními zápěstními kostmi [karpály], záprstními kostmi [metakarpály] a nakonec samotnými prsty), mají "ryby" desítky kostiček, které jako by se odvětvovaly z nějaké centrální osy procházející podélně ploutví. Pátralo se tedy po tom, kudy tato centrální osa, zvaná metapterygiální, prochází v tetrapodní končetině. Vybíhá vůbec za úroveň loketní a vřetenní kosti? Pokud ano, které kosti na ní leží?
    Holmgren – mimochodem jeden z prvních autorů, který ptačí prsty identifikoval jako 2, 3, 4 – navrhl, že u tetrapodů se osa v zápěstní oblasti ohýbá a že prsty představují od základu nové (neomorfické) struktury, "přišroubované" k jejímu konci a postrádající jakékoli homology v ploutevních kůstkách "svaloploutvých ryb" (Holmgren 1933). Jak ale ve své revizi celé debaty popisují Wagner & Larsson (2007), časem se  uchytil spíš model Watsona (1913), podle nějž metapterygiální osa prochází čtvrtým z pěti tetrapodních prstů a v končetině tetrapodů tedy nenajdeme nic, co by v zásadě nešlo odvodit z ploutevních kůstek ancestrálních "ryb". Tento model byl silně podpořen objevem tzv. primární osy, podél které chondrifikuje (chrupavkovatí) embryonální končetina. Jak ukázali Shubin & Alberch (1986), tato osa prochází kostí pažní a loketní, proximální zápěstní kostí zvanou ulnare a dále v naprosté většině případů čtvrtým distálním karpálem a prstem IV. Neplatí to ovšem pro mloky, kde primární osa prochází prochází prstem II, nebo se spíš – jak podotkli Burke et al. (1998) – v zápěstní oblasti úplně vytrácí. U všech prozkoumaných žab a amniot na ní nicméně leží prst 4, a pokud by tomu tak bylo i u ptáků, znamenalo by to, že dva prsty, které se vzápětí objevují vedle něj, musejí být číslovány jako 2 a 3.

Metapterygiální osa (červeně) probíhající ploutví australského bahníka Neoceratodus (A) a končetinou primitivně pětiprstého amniota (B), z jehož ruky byly pro zjednodušení vynechány zápěstní kosti. Pokud skutečně probíhá prstem 4, můžeme zbývající prsty snadno identifikovat. (Modifikováno z Cohn et al. 2002: Figure 1 a Towers et al. 2011: Figure 1)

    A přesto – když už se primární osa prokazatelně vychýlila jednou, není důvod, aby se nemohla vychýlit znovu. Právě s takovou argumentací přišel vynálezce celého konceptu, Neil Shubin, když se ptačím prstům začal věnovat. Už Shubin a Alberch (1986) si povšimli, že se vznik údajného ptačího prstu 5 (který sice zchrupavkovatí, ale posléze zaniká) radikálně liší od vzniku téhož elementu u všech jiných tetrapodů. Možná tedy vůbec nejde o prst 5, ale o prst 4, což by ovšem znamenalo, že primární osa musí procházet prstem 3. Došlo tedy k jejímu posunu, a hypotéza proto dostala jméno "axis-shift". Její příznivce jsem už vyjmenoval v jednom z předchozích článků; hlavní představa byla taková, že posun osy způsobila "změna ve vývojovém načasování formace prstů". Tím pádem je v pořádku, že se po straně nejdříve zformovaného prstu objevují dva další (protože jsou to staré dobré teropodní prsty I a II). I evidence by se našla – Chatterjee (1998) a Witmer (2002)* třeba upozornili na to, že ulnare, součást primární osy, v ptačí ruce mizí a nahrazuje jej "element X" neznámého původu, což jaksi svádí k myšlence, že primární osa buď vůbec dál nepokračuje, nebo je celá rozhozená. Jenže kritika byla zdrcující – jednoznačně je výchylka primární osy známá jen od mloků, kde některé autory vedla až k návrhům tak extrémním, jako je difylie tetrapodů a tedy dvojitý přechod "ryb" na souš. (Viz např. Holmgrena [1933] – jednou to měli být bahníci, z nichž se stali mloci, podruhé pak lalokoploutví, kteří dali vznik "eutetrapodům", tj. žábám a amniotům.)

    Poté přišli se spásnou myšlenkou Wagner & Gauthier (1999). Podle nich došlo v evoluci ptáků k události zvané homeotický posun (frame shift), jejíž existence logicky vyplývá z pokroků v evolučně-developmentální biologii. Ta ukázala, že "pozice" a "identita" prstu jsou překvapivě nesouvisející záležitosti. Obě závisejí na rozdílných genových interakcích probíhajících v rozdílnou dobu, a dokonce i s našimi omezenými znalostmi není vůbec těžké docílit toho, aby jeden prst vyrostl na místě (= z tzv. "zárodečné kondenzace") prstu druhého. Máme také důkazy o tom, že k homeotickému posunu čas od času v evoluci dojde přirozenou cestou; a ví se dokonce, že k jednomu takovému případu došlo zrovna u ptáků. Citovali jej už Wagner a Gauthier: u některých kiviů vzniká prst I na jiné kondenzaci, než je obvyklé – přijmeme-li na chvíli hypotézu obou autorů, podle níž už u "normálních" ptáků prsty vyrůstají odjinud, než by měly (prst I z kondenzace 2, prst II z kondenzace 3 atd.), pak u těchto mutantních kiviů vyrůstá palec z kondenzace 3. Šlo by tedy trochu zjednodušeně říct, že kiviům občas naroste palec tam, kde má slušně vychovaný tetrapod (jako třeba člověk) prostředník.
    V roce 1999 byla taková hypotéza pouze méně parsimonní (úspornou) alternativou axis-shiftu, který se obešel bez nutnosti přesunout prstní identity na jiné kondenzace. Jenže embryologové brzy získali k určení pozice prstů lepší metodu, než je spoléhání se na zakonzervovanou pozici metapterygiální osy. Zatímco dřívější zobrazovací metody založené na radioaktivním síranu ³⁵SO₄ nebo alciánové modři dokázaly detekovat pouze mimobuněčnou matrix, která vzniká až zchrupavkovatěním (chondrifikací) zárodečného mezenchymu, modernější postupy takto omezené nejsou a dovedou zachytit tvary mezenchymu ještě před tím, než se jeho buňky začnou shlukovat do "předchrupavkových" kondenzací. A s nimi byla nakonec odhalena dlouho postrádaná, čistě mezenchymová Anlage (zárodečná kondenzace) 1, která velmi rychle mizí ještě před tím, než se začne formovat chrupavka (Kundrát et al. 2002; Larsson & Wagner 2002). Tento objev vůbec nezapadá do hypotézy o posunu primární osy – pokud u ptáků opravdu prochází prstem 3, pak musí být dotyčná kondenzace pozůstatkem prstu nacházejícího se před palcem. Homeotický posun s tím naopak problém nemá, čímž si obě hypotézy svou pozici rázem prohodily.

Průřez zárodkem kuřecího křídla. Aplikace moderních embryologických zobrazovacích metod, jako jde zde využitá schopnost aglutininu podzemnice olejné vázat specifické sacharidy obsažené v glykoproteinech na membránách shlukujících se buněk, dovolila odhalit pětiprstý základní stav ptačí ruky. Problém hypotéze o posunu primární osy dělá nejanteriornější kondenzace (vyznačená šipkou a číslovaná zde jako I), která naopak pěkně zapadá do posunu homeotického. Ten ji bere jako důkaz, že ptačí prsty se vyvíjejí z kondenzací 2, 3, 4 (na obrázku zřetelně dominujících). (Zdroj: Wagner 2005: Figure 2)

    I tak se samozřejmě homeotický posun neobešel bez rozsáhlých kontroverzí. Witmer (2002), který neměl čas do své práce zakomponovat nová zjištění o pětiprstosti, tuto hypotézu zamítl jako cirkulární a radši se vrátil k posunu primární osy, podle kterého je vlastně v paleontologii celá pravda a embryologové to celou dobu měli špatně. Mnohým embryologům zase přišlo jednodušší předpokládat, že to mají špatně paleontologové (Kundrát et al. 2002; Galis et al. 2003), z čehož se zrodila tzv. hypotéza pyramidové redukce. Podle ní ptákům z pozic 2, 3, 4 rostou prsty II, III, IV, které ovšem morfologií konvergují s bývalými prsty I, II, III, což chudáky paleontology tak zmátlo, že prsty fosilií očíslovali chybně. Nelze říct, že by argumenty obou táborů nebyly znělé**, ale pro homeotický posun se začala hromadit evidence: Vargas & Fallon (2005) ukázali, že u amniot je prst I unikátní tím, že v něm nedochází k expresi genů HoxD-10, HoxD-11 a HoxD-12, a že u prstu, který ptákům vyrůstá z druhé zárodečné kondenzace, je tomu úplně stejně. (Autoři nicméně nedali frame-shiftu jednoznačnou přednost před axis-shiftem, který navrhli zachránit tím, že by se nadbytečná "kondenzace 1" interpretovala spíš jako prepollex než zbytek zakrslého palce. K tomuto návrhu se v článku ještě vrátíme.) Vargas et al. (2008) zjistili v zásadě totéž porovnáním s nejbližšími ptačími žijícími příbuznými (totiž krokodýly) a Tamura et al. (2011) – studie, o které už byla a v tomto článku ještě bude řeč – snad dokonce vůbec poprvé identifikovali mechanizmus zodpovědný za to, proč z kondenzace 2 vyrůstá prst I a ne prst II.
    Pozice hypotézy homeotického posunu se tím podstatně upevnila. Dva roky zpátky ale přišli s novou výzvou Xu et al. (2009) při popisu bizarního zástupce kladu Ceratosauria, limusaura. Už jen návrh, že teropod takto bazální by nám mohl říct cokoli podstatného o homeotickém posunu, byl docela odvážný: Wagner a Gauthier tuto událost původně namapovali na kladogram o dost blíž žijícím ptákům. Xu et al. (2009) si ale hlavně model homeotického posunu pro své potřeby dosti pozměnili: interpretovali jej jako pozvolnou událost, která navíc úplně nesetřela známky po původní pozici prstů. Ta je stále patrná v podobnosti, jakou vykazují tři (hlavní) metakarpály tetanur s metakarpály II, III a IV jiných teropodů; naproti tomu prsty, které na ně navazují, se podobají spíše prstům I, II a III. Podle Xua a kolektivu (ačkoli to ve své studii nikde nenapsali takhle natvrdo) předkové tetanur ztratili prst I a prsty II, III a IV zvolna, krůček po krůčku změnily svou morfologii tak, že ve výsledku byly k neodlišení od prstů I, II a III dřívějších teropodů. Takový návrh vyvolal u zastánců klasického frame-shiftu poprask a především evolučně-developmentální biologové poukazovali na to, že takový proces nemá s homeotickým posunem nic společného; takže např. Young et al. (2011) Xuovu hypotézu ztotožnili s dřívějším modelem pyramidové redukce a zacházeli s ní jako s konkurencí, nikoli podporou hypotézy homeotického posunu.

(Celý vývoj událostí jsem zde poměrně slušně pokryl: o limusaurovi a jeho implikacích pro homologie prstů jsem napsal v samých začátcích blogu, stejně jako jsem okomentoval reakci Wagnera a Gauthiera. Více jsem také napsal o studii Younga a kolektivu, která evidenci pro obě hypotézy důkladně porovnala.)

    Celkově ale model homeotického posunu vyšel ze sporu posílen; v neposlední řadě evidencí ze strany experimentálních embryologických studií, jako byla ta výše zmíněná Tamurova. Do modelu byly zakomponovány některé z modifikací navržených autory popisu limusaura, takže Young et al. (2011) např. nově uznávají, že k posunu došlo dřív, než Wagner a Gauthier původně předpokládali – spíš mezi celofyzoidy a averostrany (v node-based smyslu, tj. Ceratosauria + Tetanurae) než mezi megalosauroidy a neotetanurami, a že posun doprovázela tzv. zóna developmentální variability, která se manifestovala např. v podivném uspořádání ruky různých ceratosaurů. Samotný posun ale Young et al. (2011) předložili coby nepochybný fakt, a skutečně se zdálo, že s tolika nezávislými zdroji důkazů je těžké jej napadnout.

2. Towers et al. (2011)

    A to byl omyl. Právě to nedávno udělali Towers et al. (2011) ve své studii, publikované v Nature Communications (stejné místo, kde se nedávno objevila i retropozonová studie ptačí fylogeneze). Nemám ji naneštěstí k dispozici kompletní, ale zásluhou D. Marjanoviće se rozsáhlé úryvky z ní objevily na DML. [Editace z 2.10.2011: Za zaslání fulltextu studie děkuji Filipovi Tvrdému, článek jsem díky tomu mohl doplnit o obrázky.]

2.1 Nová evidence – návrat axis-shiftu

    Towers a spol. se zaměřují na zónu polarizační aktivity (ZPA) ptačího křídla, což je oblast na okraji zárodečného pupene končetiny (limb bud), která se skládá z buněk exprimujících gen pro protein zvaný Sonic hedgehog. (Ano, to je skutečně Ježek Sonic. Jak se stalo, že má figurka z videohry vlastní protein, zůstává jednou z největších záhad biologie.) U mnoha tetrapodů vzniká ze zóny polarizační aktivity vůbec první prst, který se na končetině objeví, a to je – jak bylo uvedeno výše v souvislosti s metapterygiální osou – prst IV. Experimenty Towerse a spol. přímo navazují na to, co dělali s ptačí rukou Tamura et al. (2011). Ti zjistili, že podíl této oblasti na vývoji předních a zadních končetin je úplně odlišný a že zatímco v nohou prst IV skutečně vzniká z buněk ZPA, na křídle se buňky, z nichž se stane čtvrtý prst, ze ZPA oddělí ještě před tím, než se prsty začnou formovat. To je podle Tamury a spol. vystavuje vysokým koncentracím Shh, které je de facto přeměňují v prst III. Zdálo se tak, že vůbec poprvé byl demonstrován přesný mechanizmus, jak dochází k přepnutí kondenzace tak, aby začala vyvíjet jiný prst, který hledali zastánci homeotického posunu.
    Jenže právě zde na Tamurovy experimenty navázali Towers et al. (2011). Ti sledovali buňky ze ZPA po podstatně delší dobu, a to tak, že v nich "zapnuli" expresi genu pro zelený fluorescenční protein (GFP). Pod UV zářením potom mohli sledovat, kde se buňky z polarizačního regionu nakonec octnou. Výsledek byl šokující: buňky, z nichž se stane prst s identitou III, se skutečně ze ZPA vydělují, ale ty, které v zóně zůstanou, vůbec žádný prst nevytvoří, a to i přesto, že leží přímo na primární ose. Místo toho se z nich stanou měkké tkáně na vnějším (posteriorním) okraji posledního prstu. Kondenzace 4 tedy nepřevezme identitu III – ona nikdy nevznikne. Potvrzeno je přitom Tamurovo pozorování, že na nohou je vše v pořádku – snad za to může (autoři tuto větu začínají slovy "we speculate") fakt, že v ZPA křídla umírá více buněk. Nově přidáno je  ale pozorování, že i v myší ruce pocházejí měkké tkáně na vnějším okraji 3. prstu ze zóny polarizační aktivity. Pozice primární osy tedy není u obratlovců zakonzervovaná a autoři s hrdostí znovuoživují axis-shift, se kterým to šlo od objevu "kondenzace 1" na ptačí ruce z kopce. (S tím, že až dosud byla hypotéza posunu primární osy "přehlížená", jak autoři tvrdí, bych ale asi nesouhlasil; příznivci "frame-shiftu" ji komentovali hned několikrát [Wagner 2005; Young et al. 2011].) Důsledky ale mohou být ještě dalekosáhlejší: jak na DML napsal D. Marjanović, otřesena je celá hypotéza primární osy. Nelze přitom říct, že by nedostala zabrat už dříve (viz např. Cohn et al. 2002).

Pokusy Towerse a kolektivu s kuřecím křídlem. U embryí starých 3 dny, kdy začíná docházet k expresi genu pro Sonic hedgehog, vyměnili původní ZPA za novou, zeleně světélkující. Po 7 se ukázalo, že buňky ze ZPA se nacházejí na vnějším okraji prstu 4 (a). Aby se autoři ujistili, že transplantují skutečně jen ZPA a nic jiného, prohledali dárcovské embryo ihned po odejmutí ZPA na přítomnost transkriptů (molekul mRNA), které indikují, že gen Shh je "zapnutý" a skutečně daný protein produkuje. O 4 hodiny později stejným způsobem analyzovali i embryo, do kterého ZPA přenesli. Ukázalo se, že Shh transkripty v dárcovském embryu zcela chybějí a v příjemci jsou rozeznatelné jen v místě transplantátu (b). Pokud se podíváme na zárodečné křídlo šestidenního embrya seshora, zdá se, že světélkující buňky původem ze ZPA se začínají kondenzovat do chrupavčitého zárodku prstu 4 (c). Podélný (d) a příčný (e) řez příslušnou oblastí desetidenního embrya ale ukáže, že světélkující buňky tvoří pouze měkkou tkáň přilehlou ke chrupavce, nikoli chrupavčitý základ prstu samotný. Obrázek (d) rovněž zachycuje, že buněk exprimujících protein pro fluorescenci ubývá s tím, jak postupujeme směrem od zápěstí ke špičce prstu 4. Autoři také transplantovali světélkující ZPA na vnitřní (anteriorní) stranu končetiny (přirozeně se ZPA vyskytuje jen na straně vnější), čímž zduplikovali prsty do vzorce 4-3-2-2-3-4. ZPA se ale stále podílela pouze na proužku měkkých tkání na vnějším okraji čtvrtého prstu (f, g). V další sérii experimentů autoři transplantovali světélkující ZPA z křídla na vnitřní (h) i vnější (i) stranu nohy, kde – jak je patrné z podélných průřezů (j, k) – dala vzniknout nejen měkkým tkáním, ale také chrupavce, čili kompletnímu prstu. Měřítko: (a, f, i) – 1 mm; (b, c) – 100 μm; (d, g, j, k) – 50 μm; (e) – 150 μm; (h) – 750 μm. (Zdroj: Towers et al. 2011: Figure 2)

2.2 Jak se vyrovnat s kondenzací 1, aneb jsou ptáci primitivně šestiprstí?

    Právě kondenzace 1 – ta, kterou posun osy nepředvídal, kdežto homeotický posun ano – představuje problém. Towers et al. (2011) jej berou na vědomí, ale nepřikládají mu velkou váhu. Podle nich je pochybné, zda dotyčný výběžek mezenchymu skutečně představuje zárodek prstu, a citují studii, která nalezla ještě jednu posteriorní kondenzaci (Welten et al. 2005). Ta by podle číslování "2, 3, 4" měla odpovídat prstu 6! Welten a spol. sami takovou šílenost nenavrhli a kondenzaci interpretují poměrně nudně (a pro Towerse a kolektiv spíše nepříznivě), totiž jako pisiform. "We saw no evidence for more than five digit primordia in the chick foot", napsali Welten et al. (2005:23).
    Studie Weltenové a spol. je ale pro současnou diskuzi významná ještě něčím. Autoři se totiž jako jedni z mála obrátili od posunů a pyramidových redukcí k tomu nejjednoduššímu, ale také nejpodivnějšímu vysvětlení: ptačí předci měli šest, nikoli pět prstů. Jako vždy se povedlo vyhrabat nějakou starou citaci, která to už navrhla (Schestakowa 1927) a podle které si ptáci rudiment onoho 6. prstu uchovali. Vhodným kandidátem by byl nejen již zmiňovaný pisiform, který leží ve správné pozici, ale i element X. Umožňovalo by to skutečně spoustu problémů zahladit: Herrerasaurus a Eoraptor by mohli mít tři hlavní prsty stejné jako ptáci (II, III, IV) a ty redukované vedle nich by byly nově číslovány jako V a VI. Problém spočívá v tom, že 6 prstů je o 1 prst víc, než kolik nám jich současná představa o společném předkovi všech žijících tetrapodů dovolí. U žijících tetrapodů jsou navíc výjimky z pětiprstosti dosti pochybné – nadějí jsou opět mloci, na jejichž nohou často spatřujeme tzv. "postminimus" (česky zřejmě "zámalíček"?), což je ale asi spíš jen přídavná zánártní kost. Podle některých je dokonce postminimus náš starý známý, pisiform (Gillies 1929). Holmgren (1952) pak nejenže akceptoval ztotožnění obou elementů, ale interpretoval je jako zbytky 6. prstu, přičemž prepollex ("předpalec") měl být prstem sedmým. Jakkoli je to nepravděpodobné, zcela vyloučit to nejde, jelikož fosilní příbuzní tetrapodího korunního kladu (= mlok, člověk, jejich poslední společný předek a všichni jeho potomci) skutečně sedmi prsty disponovali.
    Podle konzervativní interpretace je však pisiform prostě přídavný proximální karpál a ani element X nepředstavuje zbytek ptačího zámalíčku. Jak ale upozornil David Marjanović ve své reakci na studii Weltenové a spol., to ještě neznamená, že se musíme hypotézy o ptačí šestiprstosti vzdát. Jen místo číslování "1, 2, 3, 4, 5, zámalíček" zkusme raději "předpalec, 1, 2, 3, 4, 5". Prepollex je skutečně znám od celé řady tetrapodů, ptákům ovšem většinou hodně vzdálených: mají ho žáby, vačice, morčata a snad i ještěrka (Steiner 1934). Efemérní anteriorní kondenzaci na ruce ptačího embrya prepollex připomíná svým rychlým zánikem a drobnými rozměry, přestože u žab může osifikovat v několik elementů celkem podobných prstním článkům a i tzv. os falciforme, "falešný palec" krtků, vzniká z prepollexu. Takto interpretovaná "kondenzace 1" nás vrací zpátky k "axis-shiftu". Vysvětluje např. daleko lépe, proč neznáme žádné šestiprsté fosilní archosaury: nemít prepollex je úplně normální, nemít prst I a ponechat si místo toho prst VI je ovšem neslýchané. I záhadný element X by mohl být v novém číslování odvysvětlen, a to jako pozůstatek pátého prstu (tomu se konec konců podobá tím, že se v ruce bere víceméně odnikud, zatímco to, co bývá jako "prst 5" označováno obvykle, se odděluje z ulnare).
    Wagner (2005), jeden ze spoluautorů homeotického posunu, ovšem zareagoval na tyto spekulace velmi rychle. Je-li správným výkladem "prepollex, 1, 2, 3, 4, 5" (a osa prochází kondenzací 3), měli bychom být schopní to otestovat na embryích nejbližších žijících ptačích příbuzných, krokodýlů. Pokud u nich s metodami, s nimiž jsme dokázali anteriorní mezenchymální kondenzaci odkrýt u ptáků, najdeme prepollex, který před zchrupavkovatěním z ruky vymizí, šlo by o silnou podporu teorie posunu primární osy. Tento experiment provedli Larsson et al. (2010) a žádnou stopu po předpalci nenašli, což je také jediná námitka, kterou byli schopní proti "axis-shiftu" dát dohromady Young et al. (2011). Towers a spol. se s ní nejsou schopni moc vypořádat. Mají-li skutečně pravdu, musíme předpokládat, že krokodýli prepollex ztratili tak dokonale, že jej nelze pozorovat v žádné fázi vývoje; hlavně jde ale o skvělou motivaci zabývat se celou otázkou dál.

2.3 Od kondenzace k prstu díky ježku Sonicovi

    Autoři se rovněž zabývali otázkou, jaké mechanizmy rozhodují u ptačích prstů o výsledné morfologii. Zárodečné kondenzace vznikají na dvou různých místech: uvnitř ZPA (prst 4 a případně prst 5) a mimo něj (prsty 1, 2 a 3, jsou-li přítomny všechny). Podle autorů je toto rozdělení vynucené právě způsobem "přidělování" prstních identit, kterým jsou rozdílné hladiny Sonic hedgehogu. Při parakrinní signalizaci (kdy protein difunduje mezibuněčným prostorem k buňkám v okolí) dovedou buňky mimo ZPA rozeznat jen dostatečně velké rozdíly v koncentraci Shh, a protože buňky v ZPA dovedou proteinu vyprodukovat jen omezené množství, počet takto determinovaných prstních identit je omezen – podle autorů na 3. O tom, jaký prst vznikne z buněk samotné ZPA, rozhoduje signalizace autokrinní, při které buňka působí na vlastní receptory.
    Je pochopitelné, že u parakrinní signalizaci zaznamenávají největší koncentraci Shh ty buňky, které jsou ZPA nejblíž, a že koncentrace vzrůstá s tím, jak dlouho necháme buňky příslušný gen exprimovat. Towers et al. (2011) to dokonale ilustrovali sérií experimentů, při nichž si pohráli se zastavováním exprese Shh i růstu zárodečných kondenzací. Při včasném zastavení exprese tak na kuřecí noze dostaneme dva palce – jeden vzniklý ze ZPA a determinovaný autokrinní signalizací, druhý pocházející z buněk mimo ZPA, kterým stejnou identitu přidělila signalizace parakrinní. Při pozdějším zaražení exprese už ZPA stihlo zaujmout identitu prstu II a mimo ní vyrostly dva prsty, z nichž ten odlehlejší je teď palec a ten bližší opět prst II. Ještě později – a máme I, II, III, III, kde ze ZPA pochází druhá "III". Když expresi nezastavíme, vznikne normální kuřecí noha (už se nám po ní stýskalo) I, II, III, IV. Jindy autoři zastavili růst oblasti, z níž normálně vznikají zárodečné kondenzace pro prsty I, II a III, a to tak, aby se zde vyvinul pouze jeden prst. Pak si opět počali hrát s přerušováním exprese Sonic hedgehogu a dostali se postupem časů od dvou palců (I, I; druhé číslo vždy znamená identitu prstu vznikajícího ze ZPA) přes dva ukazováky a prostředníky až ke kombinaci III, IV.
    Vše výše uvedené se vztahuje pouze na nohu, která se chová spořádaně. U křídla při zaražení růstu příslušné zóny vznikne ruka s jediným prstem (protože ze ZPA na křídle žádný prst nevzniká), který bude v závislosti na čase přerušení exprese Shh buď I, II nebo III. Podle autorů tato vcelku jednoduchá pravidla určují identitu prstů u všech tetrapodů.

Názorné vysvětlení rozdílu mezi hypotézami homeotického posunu (frame-shift) a posunu primární osy (axis-shift). Na obrázku (a) zcela nahoře jsou nejprve namapovány ruce různých archosaurů na kladogram (který je trochu divně nakreslený a je nutné jej číst tak, že taxony vpravo jsou si blíž příbuzné než ty, které stojí nalevo od nich). Morfologie prstů – hlavně pak tzv. falangeální formulka, která říká, z kolika prstních článků každý prst sestává – jednoznačně podporují hypotézu, že prsty žijících ptáků jsou I, II, III (charakterizované formulkou 3-4-5). Dole jsou zachyceny rozdíly mezi frame-shiftem a axis-shiftem. Obě hypotézy se shodují na tom, že předci všech amniot a tedy i ptáků (jejichž morfologii dokumentuje výše zachycená Seymouria) měli prsty I, II, III, IV a V vyrůstající z kondenzací 1, 2, 3, 4, 5 (c); přičemž primární osa procházela prstem IV/4 (b). Neshoda panuje na přesném mechanizmu, jímž se z pětiprsté ruky stala ruka tříprstá. Podle homeotického posunu (d, e) se ztratily kondenzace 1 a 5 a prsty I, II, III se přenesly na kondenzace zbývající. Podle posunu osy se ztratily kondenzace 4 a 5, zbývající prsty na svých kondenzacích zůstaly (g), ale primární osa se vychýlila tak, že nyní prochází prstem 3 (f). Tuto hypotézu podporuje fakt, že ze zóny polarizační aktivity nevzniká ve fázích 18 až 21 (tedy u embrya starého 3 až 3,5 dne) prst IV, jak by tomu být mělo. (Zdroj: Towers et al. 2011: Figure 1)

3. Wang et al. (2011)

    Wang et al. (2011) mají tak trochu smůlu. Jejich studie, která novým, rafinovaným způsobem dokazuje správnost homeotického posunu, vyšla o nějaké dva měsíce poté, co byl homeotický posun vyvrácen. Tedy pozdě, ale ne dost pozdě, aby mohly být závěry Towerse a spol. ocitovány a případně rozcupovány. Wang et al. (2011) totiž nedokazují homeotický posun jako takový, jen to, že ptačí prsty mají identity I, II, III, což se pod axis-shiftem Towerse a spol. rozumí tak nějak samo sebou – jaké by taky měly mít jiné, když vyrůstají z pozic 1, 2, 3. Přesto si jejich studie zaslouží určitou minimální pozornost. Autoři v ní nasazují postup zvaný transkriptomika, který si na rozdíl od genomiky (zabývající se DNA) a proteomiky (zabývající se veškerými molekulami proteinů, které lze nalézt uvnitř jedné buňky) všímá molekul mRNA, do kterých je genetická informace obsažená v DNA transkribována. Zabývá se tedy především tím, které součástí genomu jsou aktivovány a kdy se tak děje. Autoři tedy vzali prsty z předních a zadních končetin kuřat ve dvou různých stadiích vývoje (5,5 a 7 dní starých), osekvenovali všechny mRNA transkripty, které v nich našli, rozeznali celkem přes 14 000 genů a nad výslednými daty provedli vícerozměrné škálování (MDS). Vynechali všechny geny, jejichž exprese se mezi přední a zadní končetinou lišila, a zjistili, že zbývající geny se shlukují podle dvou kritérií: jednak podle toho, z jak starého kuřete byly sekvenovány, jednak podle toho, zda se nacházejí v palci nebo zbývajících prstech. Ukázalo se přitom, že palec na noze (prst 1/I) a prst, který je palcem z hlediska teorie homeotického posunu (prst 2/I) sdílejí celou řadu vlastností, včetně toho, že v nich nedochází k expresi genů Hoxd12, Hand2, Zic3 a Lhx9, z nichž ty první dva jsou přitom dobře známými negativními markery nejvíce anteriorního prstu (v lidštině: když nejsou exprimovány, je to palec).
    Wang et al. (2011) kupodivu vůbec nebyli schopni identifikovat identity dvou zbývajících prstů na křídle. Povedlo se identifikovat několik genů, které spojují prsty II a III na křídle s prsty III a IV na noze (v tomto pořadí), v obou případech jsou však kontradikovány signálem jiných genů, který křídelní prst II spojuje s pozdním prstem II nohy a křídelní prst III s tímtéž prstem na noze u mladšího exempláře. Autoři si také povšimli, že křídelní prst III je jedinečný tím, že v něm dochází k expresi genu Socs2, což souhlasí s tím, co o něm nahlásili Tamura et al. (2011) – že je celý developmentálně divný a že má zřejmě vlastní, odvozenou identitu. Obecně se prsty na křídle zdají být podstatně více diferenciované než prsty na zadní končetině. Právě tato zjištění (a ne "potvrzení" frame-shiftu, které vyplývá už z toho, že se na studii podíleli Young a Wagner) se zdají být na studii Wangové a spol. nejcennější.


*Witmerův článek v některých místech prostě nejde nemilovat:

There is a sense among some that the embryological signal must be correct because it involves seemingly high-tech bench science and makes reference to hox genes, as opposed to the dust and dirt of paleontology.

Witmer 2002:20

**Roztomilé je, že autoři podporující homeotický posun a pyramidovou redukci si vyčítají úplně stejnou věc: přehnanou důvěru v to, že několik konkrétních fosilií nám říká, jak přesně transformace pětiprsté ruky na tříprstou probíhala. Galis et al. (2003) – jedni z těch, kteří homeotický posun odmítli a vrátili se k tradičnímu "ti druzí to mají špatně", kde "ti druzí" znamenalo paleontology – přišli s poměrně přesvědčivým argumentem: hlavním důkazem pro to, že teropodi ztratili právě prsty IV a V, je jejich výrazná redukce u herrerasaura a eoraptora. Spousta ceratosaurů (kteří jsou ptákům blíže příbuzní) ale prst IV nijak zvlášť zakrnělý nemá, což by mohlo naznačovat, že Herrerasaurus a Eoraptor jej redukovali nezávisle na ostatních teropodech a jako takoví jsou úplně irelevantní k poznání toho, co se odehrávalo na ptačí linii teropodní evoluce. (Nová hypotéza, podle níž je Eoraptor ve skutečnosti hodně primitivním sauropodomorfem, dává Galisovi a spol. za pravdu. Na druhou stranu se zdá, že redukovat prsty IV a V je spíš jakási obecná tendence všech archosaurů, protože tyto prsty jsou menší i u žijících krokodýlů.) Xu et al. (2009) se zase setkali s výtkou, že jejich model až příliš spoléhá na to, že Limusaurus je v rámci ceratosaurů opravdu tak bazální, jak jej odhalila původní fylogenetická analýza; a že si tedy uchoval dostatek primitivních znaků od společného předka ceratosaurů a tetanur, aby nám mohl říct něco zajímavého o tetanurách samotných (kam patří i ptáci, objekt našeho zájmu). To přitom nemusí být pravda: Andrea Cau jej např. ve své slavné Megamatrici vykryl jako noasaurida, tedy zvíře v rámci ceratosaurů poměrně hluboce usazené a tedy zřejmě i odvozené.

Zdroje:

• http://dml.cmnh.org/2011Aug/msg00173.html
• http://dml.cmnh.org/2011Aug/msg00175.html
• http://dml.cmnh.org/2011Aug/msg00199.html
• http://dml.cmnh.org/2005Dec/msg00213.html
• http://dml.cmnh.org/2008Nov/msg00134.html
• http://theropoda.blogspot.com/2009/06/limusaurus-inextricabilis-xu-et-al-2009.html
• Burke AC, Feduccia A, Hinchliffe R 1998 Counting fingers of birds and dinosaurs. Science 280(5362): 355a
• Cohn MJ, Lovejoy CO, Wolpert L, Coates MI 2002 Branching, segmentation and the metapterygial axis: pattern versus process in the vertebrate limb. BioEssays 24: 460–5
• Galis F, Kundrát M, Sinervo B 2003 An old controversy solved: bird embryos have five fingers. Trends Ecol Evol 18(1): 7–9
• Gillies CD 1929 The origin of the Os pisiforme. J Anat 63: 380–3
• Hinchliffe JR 1985 “One, two, three” or “two, three, four”: an embryologist’s view of the homologies of the digits and carpus of modern birds. 141–7 in Hecht MK, Ostrom JH, Viohl G, Wellnhofer P, eds. The Beginnings of Birds. Eichstätt: Freunde des Jura-Museums
• Holmgren N 1933 On the origin of the tetrapod limb. Acta Zool Stockholm 14: 185–295
• Holmgren N 1952 An embryological analysis of the mammalian carpus and its bearing upon the question of the origin of the tetrapod limb. Acta Zool Stockholm 33: 1–115
• Kundrát M, Seichert V, Russell AP, Smetana K 2002 Pentadactyl pattern of the avian wing autopodium and pyramid reduction hypothesis. J Exp Zool 294: 152–9
• Langer MC 2004 Basal Saurischians. 25–46 in Weishampel DB, Dodson P, Osmólska H, eds. The Dinosauria 2nd edition. Berkeley (CA): Univ of California Press
• Larsson HC, Heppleston AC, Elsey RM 2010 Pentadactyl ground state of the manus of Alligator mississippiensis and insights into the evolution of digital reduction in Archosauria. J Exp Zool Mol Dev Evol 314B: 571–9
• Larsson HCE, Wagner GP 2002 Pentadactyl ground state of the avian wing. J Exp Zool (Mol Dev Evol) 294: 146–51
• Schestakowa GS 1927 Die Entwicklung des Vogelflügels. Bull Soc Nat Moscou (Biol) 36: 163–210
• Shubin NH, Alberch PA 1986 Morphogenetic approach to the origin and basic organization of the tetrapod limb. Evol Biol 20: 319–87
• Steiner H 1934 Über die embryonale Hand- und Fuß-Skelettanlage bei den Crocodiliern, sowie über ihre Beziehung zur Vogel-Flügelanlage und zur ursprünglichen Tetrapoden-Extremität. Rev Suisse Zool 41: 383–96
• Tamura K, Nomura N, Seki R, Yonei-Tamura S, Yokoyama H 2011 Embryological evidence identifies wing digits in birds as digits 1, 2, and 3. Science 331(6018): 753–7
• Towers M, Signolet J, Sherman A, Sang H, Tickle C 2011 Insights into bird wing evolution and digit specification from polarizing region fate maps. Nature Comms 2: 426
• Vargas AO, Fallon JF 2005 Birds have dinosaur wings: The molecular evidence. J Exp Zool B Mol Dev Evol 304: 86–90
• Vargas AO, Kohlsdorf T, Fallon JF, VandenBrooks J, Wagner GP 2008 The evolution of HoxD-11 expression in the bird wing: insights from Alligator mississippiensis. PLoS ONE 3(10): e3325
• Wagner GP 2005 The developmental evolution of avian digit homology: an update. Theory Biosci 124: 165–83
• Wagner GP, Gauthier JA 1999 1,2,3 = 2,3,4: a solution to the problem of the homology of the digits in the avian hand. Proc Natl Acad Sci USA 96: 5111–6
• Wagner GP, Larsson HCE 2007 Fins and limbs in the study of evolutionary novelties. 49–61 in Hall BK, ed. Fins into limbs: evolution, development, and transformation. Chicago: Univ of Chicago Press
• Wang Z, Young RL, Xue H-L, Wagner GP 2011 Transcriptomic analysis of avian digits reveals conserved and derived digit identities in birds. Nature 477(7366): 583–6
• Watson DMS 1913 On the primitive tetrapod limb. Anat Anzeiger 46: 24–7
• Welten MCM, Verbeek FJ, Meijer AH, Richardson MK 2005 Gene expression and digit homology in the chicken embryo wing. Evol Dev 7(1): 18–28
• Witmer LM 2002 The debate on avian ancestry: phylogeny, function, and fossils. 3–30 in Chiappe LM, Witmer LM, eds. Mesozoic Birds: Above the Heads of the Dinosaurs. Berkeley (CA): Univ of California Press
• Xu X, Clark JM, Mo J, Choiniere J, Forster CA, Erickson GM, Hone DWE, Sullivan C, Eberth DA, Nesbitt S, Zhao Q, Hernandez R, Jia C-K, Han F-L, Guo Y 2009 A Jurassic ceratosaur from China helps clarify avian digit homologies. Nature 459(7249): 940–4
• Young RL, Bever GS, Wang Z, Wagner GP 2011 Identity of the avian wing digits: problems resolved and unsolved. Dev Dynam (Special Issue on Limb Development) 240(5): 1042–53

1. Úvod

    Jedním z dlouhodobých problémů ptačí fylogenetiky jsou příbuzenské vztahy pěvců. Tato skupina zahrnuje přes 60% terminálních taxonů ("druhů") žijících ptáků, její příbuzenství se zbytkem neoavianů (tj. všech ptáků krom paleognátů, hrabavých a vrubozobých) ale zůstávají otázkou. Morfologické analýzy dlouho navrhovaly jejich sesterskou pozici buďto vůči "srostloprstým" ("Coraciiformes"), nebo šplhavcům (Piciformes). Livezey & Zusi (2007) tyto tři taxony odkryli v polytomii – nedokázali určit, které dva formují skupinu s vyloučením toho třetího. Molekulární i morfologické rozbory se časem shodly na tom, že šplhavci ve skutečnosti patří dovnitř "srostloprstých". Společně tvoří klad, který Mayr (2011) nedávno nazval Picocoraciae. Fain & Houde (2004) odhalili na základě své kontroverzní fylogenetické studie 7. intronu β-fibrinogenu tento klad jako sesterskou skupinu pěvců. Jiné geny ale naznačovaly jiná příbuzenství: Sorenson et al. (2003) např. analyzovali 9. intron jaderného genu pro fosfoenolpyruvátovou karboxykinázu (PEPCK) a odhalili kuriózní sesterský vztah mezi pěvci a papoušky. O rok později jej ale potvrdila některá dílčí data předložená Cracraftem et al. (2004), konkrétně pak jaderný onkogen c-myc; a první fylogenomická analýza ptáků v pravém smyslu slova, kombinující údaje z pěti jaderných genů (Ericson et al. 2006), jej podpořila rovněž. Navrhla navíc, že celý spekulativní klad (papoušci + pěvci) má neméně neočekávané příbuzné, a to sokolovité (Falconidae) a seriemy.

2. Retropozony a proč jim věřit

    Výše uvedený text může naznačovat rostoucí shodu, a skutečně tomu tak v jistém ohledu je. Zároveň se ale objevovalo množství analýz, které spojitost mezi papoušky a pěvci nepotvrdily: především rozbory mitochondriální DNA mají tendence umisťovat druhou z těchto skupin na samou bázi kladu Neoaves (Slack et al. 2007); jiné analýzy tohoto typu dat ale zase podpořily příbuzenství se šplhavci (Gibb et al. 2007) či kukačkami (Pratt et al. 2009). Není proto divu, že systematiky začly lákat další zdroje znaků. Mezi nimi zaujímají prominentní místo retropozony: "skákající geny", repetitivní úseky DNA, které se začleňují do (téměř) náhodných míst genomu poté, co byly reverzně transkriptovány z nějaké molekuly RNA. Tyto úseky se dědí stejně jako kterýkoli jiný gen, vznik nového retropozonu je ovšem jedinečnou, neopakovatelnou událostí. Retropozony jsou poměrně dlouhé (v řádu stovek bází) a jejich inzerce je doprovázena tím, že se cílové místo duplikuje tak, aby vložený element původní sekvence lemovala z obou stran. Homoplazie by vyžadovala buď to, aby došlo k dokonale přesné deleci (zmizení) dříve vloženého retropozonu spolu s jednou kopií cílového místa, nebo naopak k inzerci stejného či extrémně podobného retropozonu na stejné místo genomu (přičemž možných míst inzerce je v ptačím genomu asi 1,2 miliardy). Pravděpodobnost obou variant je tak malá, že lze inzerci retropozonů řadit do kategorie tzv. vzácných genomových změn (RGC, Rare Genomic Changes), které jsou pro fylogenetika cosi jako splněný sen: dlouho přetrvávající znaky prakticky nevykazující homoplazii, ideální pro rozřešení dlouhotrvajících systematických kontroverzí.
    Je nutné si uvědomit, že rozbor retropozonových inzercí je zcela nezávislý na dosavadních pokusech fylogeneticky analyzovat genetická data, ať už šlo o DNA-DNA hybridizaci nebo výše zmiňované sekvenční analýzy. To znamená, že analýzou retropozonů můžeme dosud navržené hypotézy testovat. Suh et al. (2011) považovali za příliš lákavé nechat si takovou možnost ujít. Vzali tedy genetický materiál kuřete (Gallus gallus) a zebřičky pestré (Taeniopygia guttata) – jediných dvou ptáků, jejichž genom byl kompletně přečten (osekvenován) –, přidali k němu známé sekvence pštrosa emu (Dromaius novaehollandiae) a nechali počítač najít v nich retropozony. Celkem jich rozeznali přes 200 000. Následně se zaměřili na dvě jejich nejrozsáhlejší kategorie, zahrnující přes 97% z celkového množství: kuřecí repetice 1 (CR1), což je rodina dlouhých vmezeřených elementů (LINEs, Long Interspersed Nuclear Elements), a dlouhé koncové repetice (LTRs, Long Terminal Repeats) endogenních retrovirů. Z nich potom vybrali ty retropozony, které jsou součástí zachovaných (tedy pomalu se vyvíjejících a snadno rozeznatelných) intronů a mezigenových oblastí o velikosti menší než 1500 párů bází.
    Tyto podmínky splnilo 131 lokusů s dlouhými vmezeřenými elementy a 75 lokusů s dlouhými koncovými repeticemi. Většina z nich byla k nalezení u zebřičky, ale ne u kuřete či emu, čímž se prokázalo, že právě tyto elementy jsou relevantní k rozřešení příbuzenských vztahů mezi neoaviany. Pomocí amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a sekvenování se pokusili tyto sekvence získat i od jiných ptáků: od papouška kea (Nestor), sokola (Falco), žluny (Picus), káněte (Buteo), čápa (Ciconia) a holuba (Columba). To se ukázalo být možné pro 51 z celkových 206 původních kandidátů. Suh et al. (2011) sekvence těchto retropozonů zarovnali a sestavili z nich datovou matrici. Každý taxon může vykazovat buď primitivní, ancestrální stav (v ortologním* lokusu konkrétní retropozon chybí), kódovaný jako "–"; nebo naopak stav odvozený (došlo k inzerci příslušného retropozonu) kódovaný jako "+". Třetí možností je, že v genomu ptáka cílové místo pro konkrétní retropozon kvůli deleci zcela chybělo. Pak jej Suh et al. (2011) kódovali jako "d" (chybějící data). Následně použili PAUP k tomu, aby z matrice zrekonstruoval kladogram. Vzali přitom v úvahu návrh Waddella et al. (2001), kteří navrhli zkolabovat každou větev, která není podložena nejméně třemi navzájem nekonfliktními retropozony. (Návrh pramení z toho, že ač je konvergence u retropozonů extrémně nepravděpodobná, vyloučená není, a jeden nebo dva retropozony tedy nejsou statisticky signifikantní podporou). Výsledky analýzy vypadají následovně:

Striktní konsenzus 577 nejúspornějších stromků, vzešlých z kladistické analýzy retropozonových inzercí. Černá kolečka (pouze nad větví A) reprezentují inzerce (vložení) retropozonů, které jsou jedinečné pro ptáky jako celek; tmavošedé kuličky (např. nad větví B) symbolizují inzerce se shodným výskytem, které dávají shodný fylogenetický signál. Světle šedé kuličky (větev F) zastupují retropozony, které poskytují signály rozporné mezi sebou a s retropozonovými markery na čárkovaných větvích. Podle autorů jde o následek tzv. ILS (Incomplete Lineage Sorting) efektu (viz dále v textu), o němž je známo, že může způsobit nekompatibilitu mezi genovými genealogiemi a celkovou fylogenezí. Některé z tradičních a dobře podložených kladů se překvapivě ukázaly být bez retropozonové podpory: sem patří nejen stále trochu kontroverzní mirandorniti (plameňáci + potápky) a nepojmenovaný klad-tvořený-všemi-paleognáty-kromě-pštrosa, ale i hrabaví, vrubozobí, svišťouni nebo Picocoraciae (šplhavci + parafyletičtí "srostloprstí"). Suh et al. (2011) takové skupiny označili na výsledném kladogramu hvězdičkou. Na stromku se mi také líbí to, jak pohotově do něj autoři zařadili teprve nedávno navržená, ale vysoce užitečná jména; především pak ta z Mayrovy letošní práce – Aequornithes a Picocoraciae (Mayr 2011). (Zdroj: Suh et al. 2011: Figure 1)

    O tom, že retropozony jsou spolehlivými indikátory fylogeneze, vypovídá už fakt, že jejich analýza potvrdila většinu tradičních seskupení už dříve potvrzených morfologickými i sekvenčními daty; mezi nimi pěvce (Passeriformes), drůbež (Galloanserae), monofylii neoavianů a dělení moderních ptáků na Palaeognathae a Neognathae. Pak už můžeme přistoupit k tomu, co nám retropozony říkají o problémech, které morfologie a ani sekvenční rozbory dosud nedokázaly uspokojivě vyřešit – o bazálních divergencích skupiny Neoaves.

3. Neoaves – měkká, nebo tvrdá polytomie?

    Špatnou zprávou je, že genealogie čtyř retropozonových markerů s potenciálem rozřešit neoavianní vývojovou radiaci se ukázala být vzájemně nekonzistentní. Již bylo vysvětleno, že konvergence je v případě retropozonů na hranici nemožného: vložení stejného typu retropozonu, stejně zkráceného (truncated) a stejně orientovaného, na přesně stejné místo v genomu je vyloučena zákony pravděpodobnosti, a dokonale přesné "vystříhnutí" takového elementu by (bez ohledu na statistickou nepravděpodobnost) muselo být rozpoznáno. Suh s kolektivem proto nesrovnalosti mezi jednotlivými elementy připisují jevu zvanému "incomplete lineage sorting". Po oddělení dvou populací genetický drift v každé z nich stochasticky (náhodně) zafixuje různé alely, k tomu ovšem potřebuje nějaký čas: konkrétně 2N_e generací (kde N_e znamená efektivní velikost populace). Do té doby si obě linie, které se zvolna stávají novými taxony, udržují polymorfizmus zděděný od ancestrální populace, což znamená, že jeden lokus obsazují různé alely. Problém nastává v okamžiku, pokud se jedna z těchto linií znovu rozštěpí dřív, než genetický drift fixuje v polymorfním lokusu jednu alelu. Pak se polymorfizmus přenese do nové dvojice linií, a drift v nich potom může fixovat alely takovým způsobem, který odporuje celkové fylogenezi. Protože jeden obrázek často řekne víc, než 106 slov, kterými jsem právě zkusil incomplete lineage sorting vysvětlit, ukradnu jeden od Aviseho a Robinsona (2008), kteří pro podobné těžkosti zavedli pojem hemiplazie:

Polymorfizmus z doby před oddělením větví (A + B) a C přetrval až do doby, dokud se (A + B) sama nerozdělila na A a B, a teprve potom se fixoval takovým způsobem, který odporuje celkovému uspořádání ("species tree"). Je nutné zdůraznit, jak to činí i Avise & Robinson (2008), že genový strom není špatně. Z hlediska "species tree" nám to tak může připadat, ale v genovém stromu je (B + C) monofyletickou skupinou a fixace alely b validní homologií. Genealogie genů se v tomto případě odlišuje od genealogie taxonů, jejichž zástupce geny "obývají", což ale neznamená, že by jedna z nich musela být nutně špatně. Pěkně celou situaci vysvětluje např. Dawkins (2004): každý gen má vlastní genealogii, která se může lišit jak od genealogií jiných genů, tak i od fylogeneze organizmů, které autorův pohled zredukoval na pouhé vehikly pro velké množství genů. "Species tree" je prostě ta topologie, na které se shodne většina genů v demokratickém hlasování. (Zdroj: Avise & Robinson 2008: Figure 2)

    Hemiplazie je důležitá právě proto, že zasahuje i vzácné genomové změny. I kdyby byly všechny jevy z této kategorie skutečně dokonale prosté jakékoli homoplazie, díky hemiplazii se fylogeneze z nich odvozená stále může odlišovat od té, kterou hledáme (tj. od "species tree"). Stačí, aby měla báze kladu, jehož topologii se snažíme odhalit, větve o velmi krátké délce. Ve fylogenetice se pro taková místa ujalo neformální označení "bush" (křoví) jako variace na klasickou představu o fylogenezi, kterou ztělesňuje strom ("tree"); a jsou důvody se domnívat, že nejsou nijak vzácná (Rokas & Carroll 2006).
    Jedním z takových míst by mohla být právě báze kladu Neoaves. Poe & Chubb (2004) přišli se značně pesimistickým modelem "explozivní radiace", podle nějž je tato oblast stromu života tzv. "tvrdou polytomií", která – na rozdíl od polytomií měkkých, které jsou jen projevem nedostatku údajů spíše než fundamentálních metodologických překážek – nebude rozřešena ani sebevětším množstvím genetických dat. Mělo by jít o jedno z právě těch míst, o kterých psali Rokas a Carroll, kde ani stovky genů nedokážou poskytnout dostatečné rozlišení. Zdá se, že neshoda v retropozonových markerech, kterou zjistili Suh et al. (2011) a za kterou je zřejmě zodpovědná právě neschopnost genetického driftu zafixovat ve čtyřech problematických lokusech různé alely před tím, než se větev začala znovu štěpit, tento model pouze potvrzuje. Je ale situace skutečně tak bledá?
    Chojnowski et al. (2008) byli optimističtější. Ukázali, že ačkoli exony (kódující místa genů) skutečně nemusejí na rozřešení stromů s velice krátkými meziuzly (= "internodes" nebo prostě "větve"; myslí se tím úsek mezi dvěma divergencemi) stačit, introny by to zvládnout mohly, neboť v genových stromech odvozených z intronů dvou paralogních genů pro těžké řetězce klatrinu našli větší shodu, než jakou je možné vysvětlit čistou náhodou. Nadšení ale v květnu letošního roku zchladili Braun et al. (2011), kteří se zaměřili na další ze vzácných genomových změn: mikroinverze, tedy převrácení posloupnosti několika desítek až několika desítek tisíc bází. Jednak ukázali, že mikroinverze zase tak vzácné nejsou a vykazují homoplazii, kterou nelze vysvětlit výše popsaným mechanizmem hemiplazie; jednak spočítali, že k rozřešení meziuzlů o délce 1 milionu let pomocí mikroinverzí by bylo třeba prohledat kolem 12 milionů bází, což je o tři řády více, než používají sekvenční analýzy typu Hackett et al. (2008). Existují přitom doklady, že meziuzly na samé bázi Neoaves jsou možná ještě kratší, a to navíc stále předpokládáme, že tato oblast představuje polytomii měkkou, o čemž Braun et al. (2011) sami vyjádřili nejistotu.

4. Psittacopasserae a Eufalconimorphae

    Další potvrzení problematičnosti hlubokých příbuzenských vztahů v rámci Neoaves ale pochopitelně není to hlavní, co si ze studie Suha a kolektivu máme odnést. Jak autoři zmínili přímo ve své práci a jak ještě opětovně zdůraznil Alexander Suh v e-mailové konverzaci na DML (do které jsem měl tu čest se zapojit), hlavní je, že rozbor nového typu dat potvrdil opatrný konsenzus, který se začal rýsovat s nástupem fylogenomických studií v posledních letech. Jedním z kladů navržených sekvenčními analýzami, který má oporu také v retropozonech, jsou tzv. pozemní ptáci (o jejichž historii plánuji ještě něco napsat.) Vynořil se poprvé s velmi slušnou podporou ze studie Ericsona et al. (2006) a zahrnuje pěvce, papoušky, sokolovité, seriemy, denní dravce, sovy, myšáky, trogony, madagaskarského kurola (Leptosomus) a pikokoraciany (zoborožci, dudci, leskovci, datli, ledňáčci, vlhovití atd.). Morfologové zdánlivě podobná seskupení navrhovali již dříve, ale do moderního pojetí jim buď cosi chybělo (denní dravci, papoušci, seriemy), nebo naopak přebývalo – hlavně různé kukačky, svišťouni a "lelci" (srovnej např. "Dendrornithes" z Livezey & Zusi 2007 a "landbirds" z Hackett et al. 2008). Molekulární analýzy jsou přitom nekompromisní: Hackett et al. (2008) podložili "pozemní ptáky" s výše popsaným obsahem bootstrapovou podporu 98% a Suh et al. (2011) nyní jejich monofylii potvrzují znovu, ačkoli podle vlastních kritérií nedostatečně: našli jen 2 retropozonové inzerce místo 3 a navíc jim odporují některé ze čtyř výše zmíněných hemiplastických markerů u báze Neoaves (viz popisek k prvnímu obrázku).
    Úplně nový a dosud nikde nenavržený je další klad, sestávající ze všech pozemních ptáků kromě myšáků (Coliidae). Podpora pro něj je stejná, jako v případě pozemních ptáků samotných: dvě inzerce, které jsou v rozporu s několika dalšími markery. Přesto jde o hypotézu, která si zaslouží pozornost a další testovaní. Pozici myšáků nepomohly stabilizovat ani velké morfologické či sekvenční analýzy posledních let (jen stručně: Chubb [2004] navrhl sesterský vztah s papoušky, Livezey & Zusi [2007] s trogony a Hackett et al. [2008] se sovami), díky čemuž si tato skupinka drobných afrických ptáků buduje reputaci fylogenetické hádanky srovnatelné i s proslulým hoacinem.
    Situace se začíná lepšit s tím, jak postupujeme k méně rozsáhlým skupinám. Klad složený ze seriem, sokolů, papoušků a pěvců* sice také není podložený zvlášť dobře, ale v kombinaci s podporou, jakou pro něj přinesly velké sekvenční studie (posteriorní pravděpodobnost přes 95% v práci Ericsona a kolektivu), se jeho existence zdá být velmi pravděpodobná. Jeho vnitřní příbuzenství jsou již retropozonovými daty zdokumentována velmi dobře: klad zahrnující papoušky, pěvce a sokolovité je dokonce nejlépe podloženým seskupením v celé analýze. Podporuje jej 7 retropozonových inzercí (všechno dlouhé koncové repetice odvozené z endogenních retrovirů) a – na rozdíl od výše zmíněných příbuzenství – neodporuje jim ani jeden ze 196 zbývajících markerů; což je evidence, které nemohly konkurovat ani tak tradiční klady, jako jsou neognáti, paleognáti, drůbež nebo pěvci. Suh et al. (2011) se proto cítili dostatečně oprávněni k tomu, aby jej pojmenovali. Zvolili "Eufalconimorphae", což je označení, které na DML vyvolalo rozsáhlou diskuzi. Většina komentářů jej přitom hodnotila jako příšerné. Osobně jsem se snažil argumentovat, že název jistou logiku má – předpona "eu-", čili "praví", poukazuje na to, že sem nepatří žádní z tradičních falkoniformů, jako jsou jestřábovití, orlovci nebo hadilov – a Alexander Suh později v odpovědi na můj e-mail tuto spekulaci potvrdil.

*Tento klad nemá žádné jméno, a ani Suh et al. (2011) pro něj žádné vzhledem k nízké podpoře ze strany retropozonů nenavrhli. Boyd (2011) používá "Passerimorphae", což je, jak jsem pochopil, neustále recyklovaný výraz pro pěvce a dva až tři "řády" zrovna považované za jejich nejbližší příbuzné. Přišli s ním Sibley et al. (1988), podle nichž byly těmito "řády" holubi, "krátkokřídlí" a mimořádně inkluzivní verze "brodivých"; Livezey & Zusi (2007) jej použili pro pěvce, "srostloprsté" a šplhavce.

    V rámci eufalkonimorfů jsou pak zřejmě sokolovití (Falconidae) sesterskou skupinou kladu složeného z pěvců (Passeriformes) a papoušků (Psittaciformes). Tento klad je podložen třemi retropozony, kterým opět žádný ze zbývajících neodporuje. Jelikož sesterský vztah mezi oběma skupinami podporují také sekvence hned tří jaderných genů (Mayr 2011), rozhodli se Suh et al. (2011) pojmenovat i tento klad: Psittacopasserae. Upozorňují nicméně na nutnost dalších sekvenčních analýz, protože ačkoli nenašli žádné známky po ILS, nemohou zcela vyloučit hemiplazii v případě retropozonů spojujících papoušky a pěvce.
    Autoři se dále zaměřili na evoluční historii ptačích retropozonů. Vzali si na pomoc analýzu Pereiry a Bakera (2006), která načasování zásadních ptačích divergencí neodvodila pomocí běžných metod, jako jsou molekulární hodiny, ale bayesovskou pravděpodobnostní analýzou nad kladogramem zrekonstruovaným z mitochondriální DNA. Poté se podívali na takové retropozony, které jsou usazeny uvnitř jiných retropozonů – v genomu zebřičky pestré jich našli 995. Za předpokladu, že mladší (aktivní) retropozony se častěji vkládají do starších (neaktivních), spíš než aby tomu bylo naopak, může analýza zjistit, jaké typy těchto elementů byly aktivní v jakou dobu. Povedlo se např. identifikovat retropozony aktivní v období, než došlo k oddělení kuřecí linie (Galloanserae) od linie zebřičky (Neoaves), a také elementy, které byly aktivní v období neoavianní vývojové radiace. Zvláštní je, že jde hlavně o dlouhé koncové repetice s virovým původem, což naznačuje, že se toto období explozivního vzniku nových taxonů krylo s obdobím zvýšené aktivity endogenních retrovirů. Warren et al. (2010), kteří vloni oznámili přečtení kompletního genomu zebřičky pestré, v něm skutečně identifikovali třikrát víc dlouhých koncových repeticí, než je známo z genomu kuřete. Suh et al. (2011) zdůrazňují, že jejich datace retropozonů může významně usnadnit práci autorům budoucích analýz – dovolí jim zaměřit se přesně na ty elementy, které jsou relevantní pro právě zkoumaný úsek evoluční historie ptáků.

5. Kolikrát se ptáci naučili učit se zpívat?

    Autoři také diskutují o jedné z nejdůležitějších implikací blízkého příbuzenství papoušků a pěvců. Obě skupiny jsou totiž charakteristické svou vokalizací (hlasovými projevy): papoušci se proslavili svou imitací lidské řeči a pěvci dokonce po této schopnosti dostali své jméno – ačkoli vlastně nepřesné. Zpěv, který je naučený a nikoli výhradně vrozený, je totiž zaznamenán jen u jedné (ačkoli zdaleka největší) podskupiny pěvců, zvané Oscines (česky "zpěvní"). O sesterské skupině zpěvných, křikavých (Suboscines), a sesterské skupině celého kladu (Oscines + Suboscines), novozélandských pokřovníkovitých (Acathisittidae), kteří jsou obecně prozkoumaní velice málo, toho totiž z hlediska vokalizace příliš nevíme. Ví se, že někteří křikaví Nového světa (zástupci skupiny Tyrannides), např. tyranovití, skutečně nejsou vokálního učení schopni; zatímco jiní zástupci téhož kladu, např. kotingovití (Cotingidae) a pipulkovití (Pipridae) ano. Suhovi a spol. proto oprávněně připadá úspornější hypotéza, že hlasové učení vzniklo jen jednou u společného předka kladu Psittacopasserae a následně bylo několikrát ztraceno, než aby se u blízce příbuzných taxonů vyvíjelo několikrát nezávisle na sobě. To by znamenalo, že mozkové oblasti a vzorce genové exprese, zjištěné odděleně u papoušků a (zpěvných) pěvců – hlavně pak tzv. přední hlasová dráha v předním mozku – jsou rovněž homologické, a že jejich vznik musí být posunut do minulosti až o 30 milionů let oproti předcházejícím odhadům, které předpokládaly jejich konvergentní vývoj. Suh et al. (2011) uvádějí, že důsledky nově podloženého příbuzenství by mohly být ještě závažnější a změnit náš celkový pohled na evoluci hlasového učení.

Obrázek zachycuje příbuzenské vztahy a stavbu mozku těch ptáků, kteří jsou schopni hlasového učení: kolibříků (hummingbirds), papoušků (parrots) a zpěvných pěvců (oscine passerines), spolu s jejich nejbližšími příbuznými, kteří tuto schopnost postrádají – rorýsovitými (swifts) a sokolovitými (falcons). Schémata mozku jsou převzata z Jarvise et al. (2000) a zachycují přední (červeně) a zadní (zeleně) hlasovou dráhu spolu se zadní drahou sluchovou, centrem sluchových reflexů (modře); jejich umístění je přitom odvozeno z míst, kde dochází k exprimaci genu ZENK. U rorýsovitých a sokolovitých potřebný výzkum ještě nebyl proveden, proto u nich schémata mozku chybějí. Černý čtverec značí odvozený znak, bílý potom znak primitivní, zděděný (pleziomorfický). Do budoucna je nutné prozkoumat neuroanatomii křikavých a pokřovníkovitých, aby se zjistilo, zda je zadní hlasová dráha papoušků a zpěvných zděděná od společného předka, nebo konvergentně vyvinutá. Proužek měřítka u mozkových schémat odpovídá 2 mm. (Zdroj: Suh et al. 2011: Figure 4)

Zdroje:

• http://dml.cmnh.org/2011Aug/msg00401.html
• http://dml.cmnh.org/2011Sep/msg00004.html
• Avise JC, Robinson TJ 2008 Hemiplasy: a new term in the lexicon of phylogenetics. Syst Biol 57(3): 503–7
• Boyd JH III 2011 Taxonomy in Flux Checklist 2.52: Tree View. Accessed September 13, 2011 at http://jboyd.net/Taxo/tree_aves.html
• Braun EL, Kimball RT, Han K-L, Iuhasz-Velez NR, Bonilla AJ, Chojnowski JL, Smith JV, Bowie RCK, Braun MJ, Hackett SJ, Harshman J, Huddleston CJ, Marks BD, Miglia KJ, Moore WS, Reddy S, Sheldon FH, Witt CC, Yuri T 2011 Homoplastic microinversions and the avian tree of life. BMC Evol Biol 11: 141
• Chojnowski JL, Kimball RT, Braun EL 2008 Introns outperform exons in analyses of basal avian phylogeny using clathrin heavy chain genes. Gene 410: 89–96
• Chubb AL 2004 New nuclear evidence for the oldest divergence among neognath birds: the phylogenetic utility of ZENK (i). Mol Phylog Evol 30(1): 140–51
• Cracraft J, Barker FK, Braun M, Harshman J, Dyke GJ, Feinstein J, Stanley S, Cibois A, Schikler P, Beresford P, García-Moreno J, Sorenson MD, Yuri T, Mindell DP 2004 Phylogenetic relationships among modern birds (Neornithes): toward an avian tree of life. 468–89 in Cracraft J, Donoghue M, eds. Assembling the Tree of Life. New York: Oxford Univ Press
• Ericson PGP, Anderson CL, Britton T, Elżanowski A, Johansson US, Källersjö M, Ohlson JI, Parsons TJ, Zuccon D, Mayr G 2006 Diversification of Neoaves: Integration of molecular sequence data and fossils. Biol Lett 2(4): 543–7
• Fain MG, Houde P 2004 Parallel radiations in the primary clades of birds. Evolution 58(11): 2558–73
• Gibb GC, Kardailsky O, Kimball RT, Braun E, Penny D 2007 Mitochondrial genomes and avian phylogeny: complex characters and resolvability without explosive radiations. Mol Biol Evol 24: 269–80
• Hackett SJ, Kimball RT, Reddy S, Bowie RC, Braun EL, Braun MJ, Chojnowski JL, Cox WA, Han K, Harshman J, Huddleston CJ, Marks BD, Miglia KJ, Moore WS, Sheldon FH, Steadman DW, Witt CC, Yuri T 2008 A phylogenomic study of birds reveals their evolutionary history. Science 320(5884): 1763–8
• Jarvis ED, Ribeiro S, da Silva ML, Ventura D, Vielliard J, Mello CV 2000 Behaviourally driven gene expression reveals song nuclei in hummingbird brain. Nature 406(6796): 628–32
• Mayr G 2011 Metaves, Mirandornithes, Strisores and other novelties – a critical review of the higher-level phylogeny of neornithine birds. J Zool Syst Evol Res 49(1): 58–76
• Livezey BC, Zusi RL 2007 Higher-order phylogeny of modern birds (Theropoda, Aves: Neornithes) based on comparative anatomy: II. – Analysis and discussion. Zool J Linn Soc 149(1): 1–95
• Poe S, Chubb AL 2004 Birds in a bush: five genes indicate explosive evolution of avian orders. Evolution 58(2): 404–15
• Pratt RC, Gibb GC, Morgan-Richards M, Phillips MJ, Hendy MD, Penny D 2009 Toward resolving deep Neoaves phylogeny: data, signal enhancement, and priors. Mol Biol Evol 26: 313–26
• Rokas A, Carroll SB 2006 Bushes in the tree of life. PLoS Biol 4(11): e352
• Sibley CG, Ahlquist JE, Monroe BL Jr 1988 A classification of the living birds of the world based on DNA–DNA hybridization studies. Auk 105(3): 409–23
• Slack KE, Delsuc F, McLenachan PA, Arnason U, Penny D 2007 Resolving the root of the avian mitogenomic tree by breaking up long branches. Mol Phyl Evol 42: 1–13
• Sorenson MD, Oneal E, García-Moreno J, Mindell DP 2003 More taxa, more characters: the hoatzin problem is still unresolved. Mol Biol Evol 20: 1484–98
• Suh A, Paus M, Kiefmann M, Churakov G, Franke FA, Brosius J, Kriegs JO, Schmitz J 2011 Mesozoic retroposons reveal parrots as the closest living relatives of passerine birds. Nature Comms doi:10.1038/ncomms1448
• Waddell PJ, Kishino H, Ota R 2001 A phylogenetic foundation for comparative mammalian genomics. Genome Inform 12: 141–54
• Warren WC, Clayton DF, Ellegren H, Arnold AP, Hillier LW, Künstner A, Searle S, White S, Vilella AJ, Fairley S, Heger A, Kong L, Ponting CP, Jarvis ED, Mello CV, Minx P, Lovell P, Velho TA, Ferris M, Balakrishnan CN, Sinha S, Blatti C, London SE, Li Y, Lin YC, George J, Sweedler J, Southey B, Gunaratne P, Watson M, Nam K, Backström N, Smeds L, Nabholz B, Itoh Y, Whitney O, Pfenning AR, Howard J, Völker M, Skinner BM, Griffin DK, Ye L, McLaren WM, Flicek P, Quesada V, Velasco G, Lopez-Otin C, Puente XS, Olender T, Lancet D, Smit AF, Hubley R, Konkel MK, Walker JA, Batzer MA, Gu W, Pollock DD, Chen L, Cheng Z, Eichler EE, Stapley J, Slate J, Ekblom R, Birkhead T, Burke T, Burt D, Scharff C, Adam I, Richard H, Sultan M, Soldatov A, Lehrach H, Edwards SV, Yang SP, Li X, Graves T, Fulton L, Nelson J, Chinwalla A, Hou S, Mardis ER, Wilson RK 2010 The genome of a songbird. Nature 464(7289):757–62